Способ получения ДНК-полимеразы бактериофага Т4 в клетках ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1992 года по МПК C12N9/00 

Инфици1)уемая бактериофагом Т4 в клетках E.coli ДНК-полимераза широко применяется в молекулярной биологии и в молекулярной генетике, в частности, для изучения матричной активности ДНК, определения последователь,ностей ДНК, решения прикладных задач генной инженерии.

Также ДНК - полимераза бактериофага Т4 может быть использована для изучения действия антибиотиков, мутагенов, канцерогенов и других соединений на клеточные процессы, изучения функций белков в системах in vitro и in vivo.

Известен способ вьщеления ДНК-полимеразы из клеток E.coli CR63, зараженных бактериофагом Т4, с одновременным получением полинуклеотидки&азы, ДНК-лигазы, РПК-лигазы. .

Способ осуществляется в следзпощем.

Получают лизат бактериофага Т4 am Р -.82 на клетках ti.coli CR63, конценту

рируют его полиэтилёнгликсУлем, получают биомассу клеток E.coli В-23, инфицированных бактериофагом Т4 am К« 82, получают клеточный экстракт обработкой клеток ультразвуком, проводят фракционирование экстракта с помощью полимина Р, проводят солевую элйцию полиминовых осадков, осаждают целевые продукты сульфатом аммония и

4i очищают ферменты путем колоночной хроматографии.

Недостатками этого способа являютСОся:

о

1..Недостаточно высокий выход ДНКполимеразы бактериофага Т4 (18%);

2.Недостаточно высокий выход биомассы клеток E.coli, зараженных бактериофагом Т4 (250 г КЗ 100 л культуры) , несмотря на использование богатой питательной среды, что также приводит к низкому выходу целевого продукта;

3. Необходимость получения копцентрщзоваииого фаголизата с использованием полнэтяпенглнколя и последующей очисткой от полиэтилейгликоля, что усложняет процессу

4.Необходимость предварительного экспериментального определения оптимального количества полимина Р для фракционирования экстракта в каткдом конкретпом случае выделения ДНК-полимеразы бактериофага Т4, что такнсе услолсняет процесс.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения ДНК-полимеразы, инфицируемой бактериофагом Т4 в клетках .

Способ включает следующие операции .

1. Получение фаголизата бактериофага Т4 am № 82 на Е.coli CR-бЗ и концентрирование его полиэтиленгликолем.

: 2,,Получение биомассы клеток Е.coli В-23,, инфицированных бактериофагом Т4. ,

3. Вскрытие клеток перетиранием со стеклянными шариками (или с алюминиевой пастой). Операции 1,2,3 -получение клеточного экстракта.

4„ Действие на клеточный экстракт стрептошшинсульфатом - осаждение ДНК (вместе с.целевым продуктом).

5.Для извлечения целевого продукта используют полученный осадок. Его переводят в раствор после чего удаляют нуклеиновые кислоты, для чего проводят автолиз. При этом частично удаляются некоторые белки.

6, Фракционирование белков сульфатом аммония.

7. Очистка целевого продукта путем колоночной хроматографии: сначала ионообменная хроматография белков на фосфоцеллюлозе, затем дополнительная очистка от остатков нуклеиновых кислот на ДЭАЭ-целлолозе и гидроксилапатите.

Основными недостатками этого способа, как и пре;а)1дущих, является низкий выход целевого продукта (8%), а также слолсность процесса, обусловленная всего необходимостью проведения операции автолиза. Сложность и отрицательные доследствия этой она- рации общеизвестны. На стадии проведения автолиза происходит большая инактивация целевого продукта за счет высокой температуры (37°С) и действия

7030 .

протеаз (на что указывают сами авторы работы), а следовательно, и больигае потери.

Необходимость предварительного 5 экспериментального определения нужного количества стрептомицинсульфата (операция 4) pfiH осаждения целевого продукта совместно с ДНК в каждом конкретном.случае также усложняет процесс.

Более второстепенные факторы, также приводящие к низкому выходу продукта и усложнению процесса его получения, следующие:

1 о Необходимость предварительного получения концентрированного фаголизата с использованием полиэтиленгликоля ;

2. Малый выход биомассы клеток jE.coli, инфицированных бактериофагом Т4 (226 г из 100 л ростовой среды), несмотря на использование богатой питательной среды.

Целью настоящего изобретения яв-. ляется повышение выхода целевого продукта и упрощение способа.

Поставленная цел,ь достигается тем, что в способе получения ДНК полимеразы бактериофага Т4 в клетках E.coli, включающем получение клеточiHoro экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционирование, белков сульфатом аммония и хроматографию, извлечение целевого продукта осуществляют из супернатанта после осаходения ДНК стрептомицинсульфатом.

Сущность способа основана на том, что извлечение целевого продукта проводят из супернатанта (раствора) при оса : дении стрептомицинсульфатом, а не из осадка, как в прототипе и вовсех из-вестных способах. Экспериментальным путем авторами установлено, что в растворе (супернатанте) присутствует в 3 раза меньше ДНК ив 10 раз больше целевого продукта. То есть осадок V значительно больше загрязнен ДНК, чем супернатант. Валсно также то, что распределение целевого продукта между осадком и супернатантом при осаждении стрептомицинсульфатом остается, как .было обнаружено, практически постоянньм (85-96% целевого продукта остаетсс ся в супернатанте) в широким диапазоне концентраций стрептомицинсульфата. То есть не требуется строгого подбора концентраций последнего, что необхо, димо в способе - прототипе. вследствие вышеуказанных причин отпадает необходимость в проведении Автолиза (упрощается процесс), а также значительно увеличивается выход целевого продукта с более высокой удельной активностью. Кроме того, предложение изменить последовательность хроматографической очистки:,,сн 1чала очищать- от нуклеиновых кислот, затем от белка обеспечивает повьшение выхода целевого продукта. Это объясняется тем, что удается максимально очиститься от остатков нуклеиновых кислот, которые мешают ионообменной хроматографии белков.Заявляемый способ включает следующие операции. 1. Получение биомассы клеток Е.со11 В-23, инфицированных бактериофагом Т4. 2.Вскрытие клеток. Операции 1-2 - получение клеточного экстракта. 3.Действие на клеточный экстракт

стрептомицинсульфатом - осаждение ДНК.

Использование супернатанта для извлечения целевого продукта.

4.Фракционирование белков сульфатом аммония.

5.Очистка целевого продукта Путем колоночной хроматографии: сначал от остатков нуклеиновых кислот, пото от белков.

Способ подтверждается следующими примерами.

1. Получение биомассы клеток E.coli Б-23, зараженных бактериофагом Т4 ага Кг 82..

Для получения биомассы клеток Е. coli В-23, инфицированных бактериофагом Т4 am К 82 (мутант, сохранивший все функции, кроме ..способности лизировать клетки E.coli В), использутот модифицированную среду М9: ;Na2HP04M2H20 - 30 г; 2.0 - 6 г; NH4C1 - 2 г; (N114)504 - 4 г; MgS04X - 0,5 г; глюкоза - 5 г} аминопептид (ленинградского мясокомбина- та) - 200 м на 1 л среды рН 7,6.

Культуру E.coli В-23 выращивают в .лабораторном ферментере емкостью 250 л до концентрации НЮ клеток в 1 мл среды и заражают фагом Т4 am К 82 с множественностью 5 фаговых частиц на клетку при температуре :37С. Перед внесением фаговых частиц в ферментер заливают 300 мл раствора 1

тельного концентрирования фаговьпс частиц.

II. Получение клеточного экстракта. Для получения клеточного экстракта

30 оттаивают 100 г клеточной пасты, доводят до 300 мл 0,05 м калийфосфатным буфером рП 7,0, с 10 мм - меркаптоэтанолом. Гомогенизуют в ножевом размельчителе тканей РТ-1 за 30 с при

35 8000 об/мин. Клетки разрушают в процессе Френча при давлении 500 кг/см, пропуская дважды. Добавляют еще 250 мл 0,05 калийфосфатного буфера с 10 мм меркаптоэталоном и осаждают обломки клеток центрифугированием

(здесь и далее все центрифугирования проводят на центрифуге J-21C Beckman США 30 мин при 10000 g при ) . Получают 550 мл экстракта.

45

Далее все операции очистки целевого продукта проводят при 4°С.

III. Осаждение ДНК стрептомицинсульфатом.

К 550 МП клеточного экстракта добавляют за 30 мин при перемешивании на магнитной мешалке 100 мл 12% раствора стрептомицинсульфата, который готовят непосредственно перед употреблением. Через 45 мин отделяют оса55 Д.ОК центрифугированием. В супернатанте астается около 95% ДНК-полимеразы бактериофага Т4.

Благодаря такому осаяэдению ДНК . стрептомицинсульфатом отпала необхо0содержащего 3 г L-триптофана и 3 г цистеина. Через 120 мин инфицированную культуру охлаждают до я собирают киеточную биомассу центрифугированием в проточной центрифуге со скоростью 60 л в час. Бактериальную пасту замораживают в жидком азоте без промывания. Из 165 л. культуры получают 540 г биомассы клеток E.coli В-23, инфицированных бактериофагом Т4 am Ri 82. Для размножения бактериофага Т4 аи F 82 на клетках CR-63 используют среду, аналогичную среде для инфекции, клеток В23. Клетки JE.coli CR-63 выращивают в-15 л ростовой среды до концентрации клеток в 1 мл среды и заражают бактериофагом Т4 am с множественностью 0,1 фаговая частица на клетку при температуре 37°С. Через 6 ч концентрация фаговых частиц составляет 5x10 ° в мл среды, что позволяет инфицировать 150 л культуры клеток E.-coli В23 простым добавлением 15 л фаголизата без предваридимость в проведении автолиза и удалось почти без потерь очистить ДНКполимеразу бактериофага Т4 от зиачительной части ДНК.

IV.Фракционирование белков суль фатом аммония

К фракции III добавляют при перемешивании за 30 мин сульфат аммония из расчета: (NH) , V Смл. Через 20 мин отделяют осадок центрифугированием и к супернатанту добавляют за 30 мин при перемешивании сульфат аммония из расчета: (m)j SO И 0.078 г/мл . Через 45 .мин отбирают осадок центрифугированием и ресуспендируют в 40 мл 0,02 м калийфос.фатного буфера рН 6,2 с 2 мм ЭДТА и 10 мм Й-меркаптоэтанолом (буфер А) и диализуют 16 ч против 5 л буфера А (а супернатант досаливают до 70% сульфатом аммония и используют для вьщеления ДНК - полимеразы I).

V.Хроматография на ДЭАЭ целлолозе - от нуклеиновых кислот и некото-

рых белков

а.Колонку с ДЭАЭ целлюлозой

(6 см X 15 см) уравновешивают буфером А. Наносят отдиализованную фракцию IV и смывают белок линейным градиентом от до 0,3 м калийфосфатным буфером А (800 мл) со скоростью 120 мл/ч. Собирают все активные фракции ДНК - полимеразы бактериофага Т4, концентрируют высаливанием 70% сульфатом аммония, переводят в 15 мл 0,05 м N -ацетатного буфера рН 5,8 с 2 м ЭДТА и 10 мм р-меркаптоэтанолом (буфер Б) и диализуют 12 ч против 5 л буфера Б.

б.Хроматографическая очистка от остатков нуклеиновых кислот на сефакрил С-200.

Колонку с сефакрилом С-200 .;-.. (9,5 см у 110 см) уравновешивают буфером Б и наносят отдиализованную фракцию Va. Элюируют белки буфером Б со скоростью 60 МП/ч. Активная фракция ДНК-полимеразы бактериофага Т4 выходит при элюции примерно 400 мл буфера Б, а остатки нуклеиновых кислот при этих условиях связываются с сефакрилом и смываются элюцией 0,1 м NaCl. Собирают все активные фракции ДШС-полимеразы бактериофага ТА, диализуют за 12 ч против Юл буфера А . (со сменой буфера через каждые 4 ч).

На стадиях Ill-Va удалось значительно освободиться от остатков нук- I

леиновых кислот А 280 (А 260 меняется от 0,65 во фракции IV да 2,26 в VI фракции), сохранив почти без потерь активность ДНК-полимеразы бактериофага 14.

в.Ионообменная хроматография белков на карбоксиметилсефадекс Г-25

Колон.суЛ: карбоксиметилсёфадексом Г-25 (4,5 см к 30 см) уравновешивают буфером А и наносят отдиализованную фракцию V6. Со скоростью 120 мл/ч злюируют 800 мл линейного градиента буфера А от 0,02 до 0,25 м калийфосфатного буфера;. Фракции содержание ДНК-полимеразную активность, концентрируют диализом против 50% раствора полиэтиленгликоля (М.В.20000) и диализуют 12 ч против 5 л 0,05 м трисНС1 буфера рН 8,0 с 2 мм ЭДТА и 10 мм Д-меркаптоэтанолом (буфер В). После диализа добавляли NaCl до 0,05 м.

- .- .. .,.; .. ..--.р.;., ,.-: .

ДНК - полимераза бактериофага Т4 на этой стадии является на 95% гомогенной (из данных по электрофорезу в полиакриламидном геле).

г.Дополнительная гель-фильтрация на сефакрил С-200 - очистка от белков

Колонку после стадии V6 промывают 0 и уравновешивают буфером В с 0,05 м NaCl. Фракцию VB наносят и элюируют этим же буфером со скоростью 60 мл/ч. Фракции с полимеразной активностью больше 200 единиц активности в мл концентрируют диализом против 50% раствора полиэтиленгликоля (М.В. 20000), диализуют к 50% глицерину с 0,05 м трис-НС1 буфером рН 7,5 с 0,1 м (NH) и 10 мм -меркаптоэтанолом 0 и хранят при -20°С.

Электрофорез в полиакриламиднрм ;: геле дает единственную полосу, соответствующую ДНК - полимеразе бактериофага Т4. Загрязнений остатками 5 нуклеиновых кислот не обнаружено.

Таким образом, заявляемый способ по отношению к прототипу обладает следую1цими щзеимуществами:

1.Повышается выход целевого продукта при сохранении его высокой

удельной активности (64%). В литера.туре и практике не известно ни одного .способа получения ДНК - полимеразы бактериофага Т4 в клетке со столь высоким выходом. (

2.Упрощается процесс за счет устранения операщш автолиза

К дополнительным преимуществам ; , следует отнести то, что авторы.полу91147030 0

чают в 1,3 раза больше биомассы кле- ния концентрированного фаголизата и ток E.coli, инфицируемых бактериофа- на отечественных реактивах; том Т4, без предварительного получе-

.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ БАКТЕРИОФАГА Т4 В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA COLI, включающий получение клеточного экстракта, осаждение ДНК стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сульфатом аммония и хромато гр.афию, -отличающийся что, с целью повышения выхода и упрощения способа, извлечение целевого продукта осуществляют из супернатанта после осазкдения ДНК стрептомицинсульфатом .