(21)4027045/13
(22)21002086
(31)704362
(32)22.05.85
(33)US
(46) 30.04.91. Бюл0 № 16
(71)Монсанто Компани (US)
(72)Гвен Грабовский Криви (US)
(53)575.224„2:577„2(048)(088.8)
(56)Proc. Nat l Acac, Sci, USA, 81, p. 5403-5407.
(54)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЫЧЬЕГО ГОРМОНА РОСТА
(57)Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантного бычьего гормона роста. Цель изобретения - повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимуляции лактации у коров. Бычий гормон роста получают путем конструирования рекомбинантной плазмидной ЛНК, кодирующей бычий гормон роста в результате выделения ДНК из плазмиды pGHex-I, встраивание кодона для аланина вслед за ATG кодоном, реклонирования в плазмиду pBGFex-I, трансформации полученным ДНК штаммов Е„ coli с последующим выделением и очисткой конечного продукта. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.
в &
Изобретение относится к генетической инженерии и касается получения рекомбинантного бычьего гормона роста.
Цель изобретения - повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимуляции лактации у коров0
Бычий гормон роста получают путем конструирования рекомбинантной штазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, в результате выделения кДНК из плазмиды pGHex-I, встраивания кодона для аланина вслед за ATG кодоном, реклонирования в плазмиду р Ъ GHex-I, трансформации полученными рекомбинантными ДНК штаммов Е.со- li с последующим выделением и очисткой конечного продукта
Пример 1.
а) Кодирующую соматотропин, т.е. 6ГР (Л) последовательность ДНК, выделяют из pGHex-I как фрагмент Хва и клонируют в сайт Хва модифицированного вектора Ml3mp8 (M13mp8/ /Хва). Хва рассекает в обоих концах кодирующую 6ГР (Л) последовательность ДНК, вырезая таким образом полную кодирующую 6ГР (Л) последовательность. Плазмиду pBGHeJ( -I после обработки Лерментом I смешивают в присутствии ДНК-лигазы Т4 с РФ ДНК (РФ - репликативная Форма вектора) М13тр8/Хва1, линеаризованной при помощи эндонуклеазы рестрикции Хва, и обрабатывают щелочной еЬосЛатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота). Затем смесь инкубируют в течение ночи при
ЗЭ
С& -U
00
ы
14 С. Обработка щелочной дюсфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) предотвращает рециркуля- ризацию вектора М13тр8/Хва1. Вставку кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК в вектор М13тр8/Хва1 с целью образования рекомбинантного вектора M13mp8/BGHex-I первоначально контролируют образованием бесцветных бля- шек на культуре бактерий IM101 Е. со- 11, выращиваемой на среде 1 х УТ, используя процедуру покрытия мягким агаром, который содержит 10 мл 100 мМ ИГТГ (изопропил-($-В-тиогалактопира- нозида) и 50 мкл 2% (в/о) X-GAL (5- бром-4-хлор-3-индолил-й-В-галакто- пиранозида) в 3 мл верхнего агара, и осуществляют трансфекцию упомянутым рекомбинантным вектором аналогично описанному Вставку кодирующей 6ТР(Л последовательности подтверждают при помощи рестрикции изолированной РФ ДНК рекомбинантного вектора ферментом Хва1, в результате чего получают Фрагмент в 590 пар оснований, содержащий, вставленную последовательность Фрагмент в 590 пар оснований идентифицируют при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном агаре. Все последующие фрагменты после обработки ферментами иденти- сЬицируют именно при помощи этой процедуры. Ориентацию вставленных кодирующих 6ГР (Л) последовательностей контролируют при помощи обработки РФ рекомбинатного вектора ферментами Smal и Find III. Если кодирующие последовательности находятся в правильной З1 ориентации, в резуль- тате сечения этими ферментами рестрикции получают фрагмент в 207 пар оснований. Осуществляют изоляцию однонитевой (ОН) ДНК фага, вектор MISmpS/BGHg -I используют в качестве матрицы при сайт-специфическом мутагенезе.
Олигонуклеотидную затравку, содержащую последовательность для искомой мутации, используют для затрав ления синтеза копии замкнутой кольцевой ДНК матрицы M13mp8/BGHex-I онДНК. Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы двунитевой (ДН) ДНК отделяют от неполных колец и колец онДНК при помощи центрифугирования градиентом щелочной сахарозы. Замкнутые кольцевые молекулы днДНК используют для трансформации
0 ,- о 5
Q
5
Е. coli IM101 и полученные в результате бесцветные бляшки помещают на фильтры Пэлл и просеивают, контролируют гибридизацию в меченную Р форму олигонуклеотидной затравки, использованной для осуществления сайт-специфического мутагенеза. Фильтры промывают при увеличивающихся температурах до тех пор, пока не исчезнет радиоактивно меченный сигнал с контрольного фильтра, который приготавливают с использованием фага М13пгр8/ /BGHgj-I. Промывку фильтров осуществляют при комнатной температуре в 6 х SSC (0,9 М NaCl 0,09 М цитрата натрия) в течение 10 мин, затем при 50°С в 6 X SSC в течение 5 мин, а последующие промывки - при увеличении температуры на 5°С. Бляшки, которые гибридизировались с образованием меченной радиоактивным элементом олигонуклеотидной затравки при темпера- турах более высоких, чем контрольные фаги, считают несущими новую созданную кодирующую 6ГР (Л,Л) последовательность и называют положительными. Отдельные бесцветные бляшки отбирают из культуры трансформированных клеток IM101 Е. coli и выращивают, в 5 мл среды 2 УТ Јl,6% (в/о) триптона, 1,0% (в/о) экстракта дрожжей, 0,5% (в/о) NaClj в течение ночи при 37°С в условиях аэрации. ДНК фага затем наносят пятнами на нитроцеллюлозу, подвергают гибридизации с затравкой, меченной радиоактивным элементом, и промывают при увеличении температуры, как указано выше. ДНК фага, которые имели температуру гибридизации выше контрольных бляшек M13mp8/BGHex-I, являются потенциально положительными.
Потенциально положительные бляшки из обеих процедур выращивают и используют для получения онДНК фага, анализируют последовательность онДНК, чтобы подтвердить, что она действительно несет кодирующую 6ГР (А,Л) последовательность. РФ ДНК М13тр8/ /BGHex-I (ala) тоже анализируют, отбирают при помощи анализа ферментом рестрикции Нае III с тем, чтобы убедиться в присоединении кодона аланина после комплекса сигналов начала кодон метионина АТС, так как при создании кодона аланина образуются дополнительные сайт-ограничения Нае III, частота присоединения кодона
аланина составляет примерно 2% кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК.
б( Конструкцию кодирующей 6ГР (А,В) последовательности ДНК отбор и анализ последовательности осуществляют аналогично описанному, но матрицей
вательность ДНК. Затем трансформированные Е. coli IM101 выращивают на среде 1 УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществляют по образованию бесцветных бляшек аналогично описанному.
Вставку кодирующих сГР (Ф) после является M13mp8/BGHex-I (ala), а олигону-довательностей ДНК подтверждают слеклеотидная затравка указана в табл. 1 Частота превращения кодона лейцина в кодон валяна составляет примерно 10%„
В табл. 1 показано конструирова- .ние кодирующих соматотропин с К-кон- цевым аланином последовательностей.
в) Конструкцию кодирующей 6ГР (В) последовательности ДНК, отбор и анализ последовательности проводят аналогично описанному. При этом матрицей является M13mp8/BGF -I, а олиго- нуклеотидная затравка используется та же, что и при конструировании 6ГР (А,В). Частота превращения кодона лейцина в кодон валина составляет примерно 10%.
Используют олигонуклеотидный сайт- специфический мутагенез, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР (Ф) последовательности ДНК.
Кодирующую сГР (Ф) последовательность ДНК в 590 пар оснований, содержащуюся на плазмиде PPGHex-I, вы- деляют из этой плазмиды при помощи эвдонуклеазого сечения EcoRI и Hind III которые рассекают плазмиду в 5 -и 3 концах кодирующей сГР (Ф) последовательности. Рассеченную плазмиду pPGHex I смешивают с РФ ДНК М13тр9, который разрезают эндонуклеазами EcoRI и Hind III и предварительно обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции М13щр9. Затем в упомянутую смесь добавляют ДНК-лигазу Т4. Благодаря наличию отклоняющихся от нормы концов на РФ ДНК фага и кодирующей гГР (Ф) последовательности ДНК, образованных при использовании .двух различных Ферментов рестрикции, ДНК сГР (Ф) селективно вставляют в РФ ДНК фага в правильной 51 ориентации. Затем осуществляют трансформацию Е. coli IM101 в соответствии с описанием, приведенным выше для M13mp8/BGHЈX I, при помощи рекомби- нантного вектора M13mp9/PGHex-I, несущего кодирующую сП5 («г) последо10
20
25
30
дующим образом. Выбирают бесцветные бляшки, а РФ ДНК М13шр9/РСНех-1 рас- секают эндонуклеазами EcoRI иHind III и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают J5 фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф)0 Зате Фаг M13mp9/PGHex -I размножают в Е0co li Ш101, выделяют онПНК фага.
ДНК Ml3mp9/PGRex-I используют в качестве матрицы для сайт-специфического мутагенеза, как описано выше, конструирования кодирующей 6ГР (А,Л) последовательности, используя специальную затравку (табл. 1), Частота присоединения кодона аланина, в данном случае ПСС, к кодирующей сГР (Ф) последовательности, составляет примерно 12%. Получение кодирующей сГР (А) последовательности опдтверж- дают анализ последовательности ДНК.
Пример2. Получают три полипептида, соматотропины видов 6ГР (А, Л), 6ГР (А,В) и сГР (А).
Кодирующие 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В) 3 и 6ГР (В) последовательности ДИК, содержащиеся на рекомбинантных векторах Mi3mp8/BGHex-I (ala), М13тпр8/ВОНе 1-1. (ala, val) и М13шр8/ /BGPe}C-I (val), соответственно исполь зуют для замены кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК, содержащейся на плазмиде экспрессии pBGH х-1. Это осуществляют при помощи переваривания соответствующих РФ ДНК М13 45 ферментом Хва1. Глазмиду экспрессии pBGFex-I переваривают эндонуклеазой Хва1, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции. Каждую из переваренных РФ ДНК смешивают с пере- ваненой ДНК рВОКех-1 и подвергают лигации в течение ночи при 14°С. . Полученные таким образом рекомбинант- ные векторы экспрессии, которые обозначают рМОМ 3209, pMON 3215 и рМОК 3214, несут кодирующие 6ГР (А,Л), ) и бг (В) последовательнос40
50
55
вательность ДНК. Затем трансформированные Е. coli IM101 выращивают на среде 1 УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществляют по образованию бесцветных бляшек аналогично описанному.
Вставку кодирующих сГР (Ф) послеу-довательностей ДНК подтверждают сле0
0
5
0
дующим образом. Выбирают бесцветные бляшки, а РФ ДНК М13шр9/РСНех-1 рас- -V секают эндонуклеазами EcoRI иHind III и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают 5 фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф)0 Затем Фаг M13mp9/PGHex -I размножают в Е0coli Ш101, выделяют онПНК фага.
ДНК Ml3mp9/PGRex-I используют в i качестве матрицы для сайт-специфического мутагенеза, как описано выше, конструирования кодирующей 6ГР (А,Л) последовательности, используя специальную затравку (табл. 1), Частота присоединения кодона аланина, в данном случае ПСС, к кодирующей сГР (Ф) последовательности, составляет примерно 12%. Получение кодирующей сГР (А) последовательности опдтверж- дают анализ последовательности ДНК.
Пример2. Получают три полипептида, соматотропины видов 6ГР (А, Л), 6ГР (А,В) и сГР (А).
Кодирующие 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В) и 6ГР (В) последовательности ДИК, содержащиеся на рекомбинантных векторах Mi3mp8/BGHex-I (ala), М13тпр8/ВОНе 1-1. (ala, val) и М13шр8/ /BGPe}C-I (val), соответственно используют для замены кодирующей 6ГР (Л) последовательности ДНК, содержащейся на плазмиде экспрессии pBGH х-1. Это осуществляют при помощи переваривания соответствующих РФ ДНК М13 5 ферментом Хва1. Глазмиду экспрессии pBGFex-I переваривают эндонуклеазой Хва1, а затем обрабатывают щелочной фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов рестрикции. Каждую из переваренных РФ ДНК смешивают с пере- ваненой ДНК рВОКех-1 и подвергают лигации в течение ночи при 14°С. . Полученные таким образом рекомбинант- ные векторы экспрессии, которые обозначают рМОМ 3209, pMON 3215 и рМОК 3214, несут кодирующие 6ГР (А,Л), ) и бг (В) последовательнос0
0
5
ти ДНК соответственное, Затем Е. со- li W 3110 подвергают трансформации .смесью, содержащей pMON 3209 или pMON 3215, или pMON 3214, или pBGFex-I, и выращивают в бульоне Лауриа (БЛ), содержащем 1% (в/о) триптона, 0,5% (в/о) экстракта дрожжей и 0,5% (в/о) NaCl, а также 12,5 мкг/мл тетрациклина и200мкг/мл ампициллина. Штамм Е. coli W 3110 с плазмидой pMON 3209 задепонирован под номером АТСС 53024,, Штамм Е„ coli W 3110 с плазмидой pMON 3215 задепонирован под номером АТСС 53022„ ТрансЛорма цию осуществляют следующим образом. Приблизительно 50 мл культуры Е. coli W 3110 выращивают в среде БЛ до ОП600 0,60„ Клетки извлекают в виде таблетки и вновь суспендируют в 10 мл буфера А, содержащего 25 мҐ трис, рН 7,6, и .10 мМ NaClc Затем клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в 1 мл бу Ьера А, в который добавляют 14 мл буфера В, содержащего 25 мМ трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 50 мМ CaClz, и суспензию инкубируют на льду в течение 30 мин. Далее клетки извлекают в дюрме таблетки и вновь суспендируют в 3 мл буфера В. Порцию в 0,2 мл суспендированных клеток вновь смешивают с 0,t мл буфера В и 0,1-0,5 мкг рекомбинантным вектором экспрессии (pMON 3209 или pMON 3215, pMON 3214 или ВГ-Нех-1) и инкубируют на льду в
lex
течение 60 мин., Затем инкубированную смесь нагревают на 1 мин при 37°С, после чего добавляют 3 мл среды БЛ. Далее полученную в результате смесь инкубируют в течение 60 мин при 37°С. Клетки извлекают в форме таблетки и вновь суспендируют в 300 мл среды БЛ и выращивают на пластинках с БЛ, содержащих вышеназванные антибиотики. Далее отбирают стойкие колонии и выделяют ДНК векторов экспрессии pMON 3209, pMON 3215, рВСНех-1 и рМОИ 3214. ДНК pMON 3209, pMON 3215, рВГ-Рех-1 и pMON 3214 анализируют на наличие фрагмента Хва в 590 пар оснований и фрагмента Kind III/Smal в 200 пар оснований, подтверждающих наличие кодирующих 6ГР (А,Л), 6ГР (В) и 6ГР (А,В) последовательностей ДНК в правильной ориентации Далее плазмиды экспресси pMON 3209 и pltON 3215 анализируют при помощи анализа эндонуклеазами
0
5
0
5
0
5
0
5
рестрикции (Пае III) с тем, чтобы убедиться в присутствии нового сайта Нае III, образовавшегося при присоединении кодона ГСС (аланина). Фрагмент Хва в 590 пар оснований из векторов pHON 3209, рМОК 3214 и pMON 3215 анализируют на состав последовательности с тем, чтобы подтвердить присутствие в этих векторах экспрессии кодирующих для 6ГР (А,Л), 6ГР (Е) и 6ГР (А,В) последовательностей ДНК„
Отдельные колонии Е. coli W 3110, несущие плазмиды pMON 3209, pHON 3214, BOHejt-I или pMON 3215, помещают в 5 мл БЛ, содержащего 12,5 мкг/мл тетрациклина, и выращивают в течение ночи при 37°С при аэрации. После чего 0,5 мл каждой культуры используют для выращивания отдельно на 25 мл среды М9, содержащей (на 1 л среды) 100 мл солей (70 г , 30 г КНгР04, 5 г NaCl, 10 г ТР4С1 на 1000 мл общего объема), 1,2 мл 1 М раствора MgSO., 0,25 мл 0,1%-ного В4 , 12,5 мл 20%-ного (в/о) раствора глюкозы, 0,025 мл 1 М раствора СаС1, дополненной 0,5% (в/о) казаминовых кислот и 6,25 мкг/мл тетрациклина и содержащейся в 250-миллиметровой колбе. Каждую культуру выращивают при 37°С в условиях аэрации до тех пор, пока ОП600 (оптическая плотность в диапазоне 600 нм) не достигнет х 1,0. Далее 0,2 мл извлекают из каждой упомянутой колбы и отдельно подвергают лизированию в буфере додецил- сульфатнатрия (ДСН) полиакриламид- ного гелевого электрофореза (ПАГЭ) и и анализируют методом ДСН-ПАГЭ„ Протеины с молекулярным весом 22000 дальтон в высоких концентрациях получают в культуре Е. coli W 3110 для обеих генетических конструкций, Клетки культуты Е. coli W 3110, несущие плазмиду pBR322, не продуцируют протеин в 22000 дальтон, который связывается с антителами антисоматотропи- на.
Бактерии, несущие плазмиды pMON 3209, pMON 3214, рВПНех-1 и pMON 3215, хранят следующим образом. Каждую колонию культуры Е. coli W 3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (pMON 3209 или рМШ 3215, pMON 3214 или pBGHex-I), выращивают в течение ночи при 37°С в 5 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина при аэрации. Порцию в 1 мл каж
дои культуры после выращивания в течение ночи добавляют отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина и выращивают до достижения ОПбООв1,0. Затем клетки из каждой колбы собирают центрифугированием при ускорении 6000 х g при 4°С в течение 5 мин таблетки. Отдельно суспендируют сяо- ва в 12 мл БЛ плюс 7,5% (в/в) ДМСО и очень быстро замораживают на сухом льду порциями в t мл„ Далее клетки хранят в холодильнике с жидким азотом. 10 мкг очищенной ДНК плазмиды хранят при -80°С.
Кодирующую сГР (А) последовательность, содержащуюся на рекомбннант- ном векторе M13mp9/PGHex-I Cala), используют для того, чтобы заменить кодирующую 6ГР (Л) последовательность ДНК, содержащуюся на модифицированном векторе экспрессии Модифицированный вектор экспрессии pBGHex-if является вектором экс- прессии pBGHe)(-I, в котором сайт ограничения EeoRI, расположенный вверх от промотора триптофана (ptr p), удален. Модифицированный вектор экспрессии pBGHex-I конструируют при помощи частичного переваривания ферментом EcoRI pBGHex-I с последующей обработкой нуклеазой SI с тем, чтобы удалить липкие концы Вектор
pBGHav-I после рестрикции подверга
ют рециркуляризации с использованием
/ДНК-лигазы Т4, а затем используют для трансформации культуры Е. со- li JM101. Все это осуществляют в соответствии с описанным ранее. ДНК плазмиды из каждой колонии анализируют на наличие фрагмента EcoRI/ /Hind III в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР (А) последовательность, и Фрагмента EcoRI/ /Pst I в 1050 пар оснований, несущего последовательность ptr p. Удаление этого EcoRI сайта рестрикции упрощает сайт-специфическую вставку специального сайта кодирующей сГР (А) последовательности в вектор экспрес- сии pBRHex-I в правильной ориентации. Рекомбинантный вектор экспрессии, полученный таким образом, в дальнейшем обозначают pMON 3213. Смесь, содержащую рМШ 3213, используют для трансформации культуры Е. coliW3110, затем трансформированные клетки выращивают и подвергают селекции:Куль5
0
„
тура Е„ coli W 3110, содержащая pMON 3213, депонирована под номером АТСС 53023. Замену кодирующей сГР (Л) последовательности кодирующей сГР (А) последовательностью в векторе экспрессии pBGHe)(-I под- (тверждают при помощи выделения ДНК pMON 3213 и последующем сечении упомянутого вектора экспрессии эндону- клеазамн EcoRI и Hind III и получают фрагмент в 590 пар оснований, а сечение с использованием Нае III показывает присутствие дополнительного Нае III фрагмента рестрикции, который образуется из-за присутствия кодона аланина в кодирующей сГР (А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение присутствия кодирующей сГР (А) последовательности ДНК в векторе экспрессии рМШ 3213 получают при помощи частичного анализа последовательности фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований
Экспрессию кодирующей сГР (А) последовательности ДНК и продуцирование сГР (А) в культуре Е. coliW3110 .осуществляют прм помощи тех же приемов, которые были описаны ранее и использовались при получении 6ГР (А, Л) и 6ГР (А,В). Аналогичным образом получают высокие концентрации протеинов в 22000 дальтон что устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ. Клетки Е. coll W 3110, несущие вектор эксперссии pMON 3213, хранят так же, кик описано ранее и используют для получения в больших количествах сГР (А) (ферментацию осуществляют в 10-100-литровых емкостях. Содержание протеина сГР (А) в реакторе-ферментации емкостью 100 л составляет приблизительно I г/л бульона.
Примерз Соматотропные полипептиды, синтезированные в культуре Е„ coli, подвергают очистке из неочищенных солюбилиэированных светопреломляющих тел, содержащих один из 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В), met - 6ГР (В), met - 6ГР (Л) или сГР (А) при помощи иммуноадсорбентной хроматографии0 Все три вида соматотропина, очищенные при помощи иммуноадсорбентной хроматографии, имели чистоту, превышающую 95%. Этот факт устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ с использованием 1 мг очищенного протеина на 7,5-15%-ном (в/о) градиентном геле. Концентрации протеинов очищенных ви
П16
дов 6ГР определяют при помощи известного анализа с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии „
Протеины, очищенные при помощи хроматографии, основанной на принципе иммунного средства, для использования в анализе на N-концевую последовательность, подвергают диализу до полного удаления воды, а затем лио- филизируют„ Перед выполнением анализ fr-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендируют в буфер бикарбоната аммония, содержащий 50 мМ бикарбоната аммония плюс 0,1% (в/о) ДСН, и подвергают диализу против того же буфера с тем, чтоб удалить остаточные трис/оксиметил/ /аминометан/трис/ и глицин,
Б табл. 2 приведены результаты анализа N-концевой последовательностей для нескольких препаратов полипептидов 6ГР (А,Л), 6ГР (А,В), met - 6ГР (В), met - 6ГР (Л) и сГР (А). Количество протеина с N-концевым мети онином приведено в процентах от общего содержания соматотропина в пробе . Для определения количества ме- тионина используют два метода. При помощи непрямого метода количество NHv-met-ala-рЪе... в преобладающей популяции NH2 ala-pheoо о вычисляют исходя из различий в lag-сигналах. Так как эта процедура зависит от некоторой оценки нормального запаздывания для последовательности, которое изменяется от цикла к циклу, она является лишь весьма грубой оценкой для содержащейся последовательности NH -ala-phe... Прямой метод, содержащий реакцию молекулярной деградации Эдмана, заключается в сравнении мощности сигналов от PTH-tnet относительно PTH-ala после отделения PTH-met от химического шума с использованием высокоразрешающей 1 жидкостной хроматографии (ВРЖХ). В частности, реакция деградации Эдмана заключается во взаимодействии N- концевой аминокислоты с реагентом, который отсекает эту аминокислоту, и в ее последующем высвобождении в форме РТН-производНого этой аминокислоты. Последняя процедура будет давать хорошие оценки (%) для met-ala- phe... в том случае, если загрязнение свободной аминокислотой является низким.
5
0
5
489
.
0
5
0
5
0
11
Степень обработки N-концевого ме- тионина варьирует в клетках от ферментации к ферментации, но всегда происходит в не менее 80% от всех молекул соматотропина.
Пример40 В табл„ 3 показано изменение надоев молока, вызванное инъекцией солюбилизованных видов 6ГР коровам Из полученный данных видно, что 6ГР (А,В) и met-бГР стимулируют надои молока в гораздо более значительной степени, чем соответствующие им (содержащие лейцин) аналоги 6ГР (А,Л) и met-бГР (Л). Кроме того, испытываемые валиновые 6ГР- виды при совместном сопоставлении с лейциновым бРР-видами дают в ста тистическом смысле (,02) более значительный прирост надоев молока
Исследование проводят следующим образом.
Коровам породы Холетеин в период их второго и третьего триместра лактации дают 5 мл раствора бикарбоната натрия (рН 9,8+0,5), только (контроль) или содержащего примерно 25 мг 6ГР (А,В), 6ГР (А,Л), met - 6ГР (В) или met - 6ГР (Л) в дальнейшем все эти смеси вместе именуются испытуемыми соматотропинами), ежедневно. Все испытуемые соматотропины и контрольные пробы применяют парентерально при помощи внутримышечной инъекции в полусухожильную мыцщу ежедневно в течение 21 дня. Фиксируют ежедневный удой каждой коровы, начи- ная за шесть дней до первой ежедневной инъекции и на протяжении 21 дня, в течение которых делали инъекции„ Анализируют каждую жирность, содержание протеинов в молоке и соматические клетки Результаты, представленные в табл. 3, указывают, что увеличение надоев молока, полученное при применении 6ГР (А,В) к коровам, примерно на 50% выше, чем полученное при использовании 6ГР (А,Л) и примерно на 17% выше при применении met - 6ГР (В),чем при применении met - 6ГР (Л).
г
Формула изобретения
Способ получения бычьего гормона роста, включающий получение кДНК, кодирующей бычий гормон роста, встраивание кДНК в бактериофаг, трансформацию полученными рекомбинантными фагами штаммов Escherichia coli, отбор клонов, содержащих рекомбинант- ные плазмиды с геном бычьего гормона, выделение рекомбинантных плазмид и встраивание кДНК из этих плаэмид в вектор экспрессии с последующей трансформацией полученной плазмидой экспрессии штаммов Е. coli, отбором .трансформированных штаммов, культивированием в питательной среде, выделением и очисткой конечного продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения биологической активности бычьего гормона роста в
pGH(A) 51 CCAGTGMTTCTATGGCCTTCCCAGCTATG M13mp9/PGHey-I
Проба
Количество протеина с N-концевым метионином проведено в пересчете на проценты от общего содержания сома- тотропина в пробе. Данные для протеина, очищенного после проведения двух отдельных ферментации.
отношении стимуляции лактации у коров, фрагмент кДНК, выделенный из плазмиды pGHex-I, с помощью сайт- специфического мутагенеза встраивают кодон для алаиина вслед за АТС кодо- ном и полученный модифицированный фрагмент реклонируют в плазмиду pBGHfrj{-I вместо последовательности ДНК, кодирующей BGH (L).
Таблица 1
pMON 3213
Таблица 2
N-концевой метионин , %
Непрямой I Прямой
1
Примечание,, Значения приведены в пересчете по методу наименьших квадратов (в килограммах) на корову (в день) молокл с нормализованной жидкостью в 3,5% жира.
Таблица 3
