Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста Советский патент 1989 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста.

Целью изобретения является повышение выхода метионинового гормона роста

Конструирование плазмиды осуществляют путем объединения BamHI-Xbal или BamHl-EcoRI фрагмента плаэмиды pCZIOl с Xbal-BamHI фрагментом плазмиды рШ789Ь с BamHI-FnuII фрагментом плазмиды pNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК присоединяют EcoRI-Clal фрагмент плазмиды pNM608 с синтетическим линкером.

Способ иллюстрируется следующими

примерами

Пример Ь В качестве исходного материала используют « 5,1Kb фрагмент, полученный ХЬаТ-ВагаН расщеплением плазмнды pKEN021.

Плазмиду pKEN021 получают из pKENIII следующим образом: около 50 мкг pKENIII выжигают 25 ед. Hpall рестрикционного фермента в 300 мкл буфера, содержащего 20 мМ НС1 (рН 7,4), 10 мМ MgCl« и 6 мМ р -мер- каптозтанола, при 37 С в течение 2 ч. Полученную смесь дважды экстрагируют 300 мкл смеси (50:50) фенола и хлороформа о Вьщеленную водную фазу осаждают затем 2,5 объемами этанола и объемами ЗМ ацетата натрия, ДНК растворяют в 100 мкл электрофо42ь

QD

СО

о:

см

резного буфера и фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле (акрил- амид: бис отношение составляет 29:1 во всех гелях, кроме тех, на которые есть специальное указание). Гель окрашивают в растворе, содержащем 0,5 мкг/мл этидиумбромида, и проявляют полосы длинноволновым ультрафиолетовым излучением. Полосу 950Ьр выделяют и извлекают из -епя электро- элюированием в камере диализа. Затем проводят экстракцию смесью фе- нол/СНС1з и бсаждение этанолом. Вьщеленные ДНК (приблизительно 2,5 мкг) растворяют в 25 мкл TEN (10 NaCl, 10 мМ iris HCl, рН 7,4, и 1 1 натрийэтилендинитрилтетра- ацатата ХЕДТА), рН 8,0).

Около 2 мкг 950Ьр Hpall фрагмента выжигают Alul рестрикционным ферментом в 200 мкл буфера, содержащего 50 КФ1 NaCl, 6 мМ Tris. HCl (рН 7,6), 6 мМ MgClij и 6 мМ р -меркаптоэтанола, в течение 2 ч при 37 С. ДНК фракй ио- нируют на 6%-ном полиакриламидном геле. Полученный 462Ьр Alul фрагмент вьзделяют и очищают описанным ранее способом. Фрагмент Alul (приблизительно 1 мкг) растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера (66 1 Tris HCl, рН 7,6; lOMMMgCl, 10 i дитиотретиол, 0,4 мМ ATP), содержащего 150 пмоль фосфорилирован- ного EcoRI линкера (5 GGAATTCC3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. После инкубирования при 4°С в течение 16 ч полученную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин и разбавляют до 1000 мкл, добавляя EcoRI буфер (100 мМ Tris HCl, рН 7,2; 50 мМ NaCi, 10 мМ , 6 мМ р-меркапто- этанола) и 40 единиц EcoRI фермента. Спустя 2 ч при образец экстрагируют смесью фенол/СНСЦ и осаждают этанолом, ДНК растворяют в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 0,1 едо Т4 ДНК лигазы и 0,1 мкг PBR322/102, которая была сначала .линеаризирована EcoRI, а затем обработана щелочной фосфата- зой. После лигирования при 4 С в течение 16 v полученную ДНК используют для обычной трансформации E.coli штамм К12 НВЮК

Трансформанты выбирают на агарных пластинах, содержащих 12 мкг/мл тетрациклина, плазмиды изолируют из устойчивых колоний методом быстрой ще0

5

0

5

0

5

5

0

5

лочной экстракции„ Плазмиду, содержащую 466Ьр Xbal-BatnHI фрагмент, выбирают и используют в качестве исходного материала на описанной далее стадии о

Около 2 мкг этой плазмиды выжигают 2 ед, Hindlll фермента в 50 мкл Hindlll буфера (50 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl, рН 7,4; 10 мМ MgCl и 6 мМ р -меркаптоэтанола) в течение часа при 37°С, После экстрагирования смесью фенол/СНС1 и осаждения этанолом ДНК растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 300 мМ NaCl, 30 мМ нат- рийацетата (рН 4,25), 1 мМ ZnClg и 200 ед, Я1нуклеазы, Спустя час при 15 С реакцию останавливают экстракцией смесью феиол/СНС1з и осаждением этанолом, ПолученнуЬ ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК лигаэного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированных BamHI линкеров (5 CCGGATCCGG3 ) и 2 ед, Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при 4 С реакционную смесь нагревают при 65 С в течение 10 мин для инактивации лигазы, а затем разбавляют до 100 мкл в BamHI буфере (150 мМ NaCl, 20 мМ Tris HCl, рН 8,0; 10 i MgCl(j, 6 ьМ Ь-меркаптоэтанола) , содержащем 20 еДо ВатНТ фермента Спустя 2 ч при 37 С полученную смесь очищают на 1%-ном агарозном геле. Гель окрашивают, больший фрагмент (4,5 kb) вьщеляют элюированием после вымораживания, а затем очищают, экстрагируя смесью фенол/СНС1з и осаждая этанолом Выделенный фрагмент с BamHI липкими концами растворяют в 20 мкл Q Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 0,1 ед, Т4 ДНК лигазы. Спустя 16 ч при ДНК используют для трансфор мацни E,coli HBlO-lo Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину- при 100 мкг/мл и скринируют по чувствительности к 10 мкг/мл тетра- циклинао Некоторые плазмиды, являющиеся Ар Тс, исследуют на отсутствие Hindlll сайта и присутствие одиночного BamHI сайта, EcoRI, Sail последовательная обработка дает фраг - мент 466 и 305Ьр,Плазмиду с такими характеристиками отбирают, а затем модифицируют для превращения EcoRI сайта, расположенного раньше 1рр промотора, в Hindlll рестрикционный сай т.

2 мкг плазмиды гидролизуют в 100 мкл EcoRI буфера с 0,2 ед, EcoRI

в течение 10 мин при 37°С, Реакцию останпиливают, нат ревая в течение 10 мин при h5°C, а после экстрагирования смесью фенол/СНС1т, ДНК осаждают этанолом, растворяют в 200 мкл SI нуклеазного буфера, содержащего S1 нуклеазу при 1000 ед/мл, и ведут реакцию при в течение часа. PeaKUHXJ останавливают экстрагированием смесью фенол/СНС1л, и осаждением этанолом о Полученную ДНК вновь суспендируют в 10 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфо- рилированного Hindlll линкера (5 CCAAGCTTGG 3) и 2 ед. Т4 ДНК лигазЫо Спустя 16 ч при смесь на гревают в течение 10 мин при 65 С, разбавляют до 150 мкл Hindlll буфером, содержащим 10 ед, Hindlll фермента, инкубируют в течение 2 ч при 37°С, а затем фракционируют на 1%-но агарозном геле. Самую большую полосу (эквивалентную единичному отрезку плазмиды) обычным способом выделяют и очищают, растворяют в 20 мкл Т4 лигазного буфера, содержащего 0,2 ед. Т4 лигазы, инкубируют 16 ч при , а зЗтем используют для трансформации E.coli НВ101. Трансформанты отбирают по устойчивости к ампициллину, выделенные плазмиды анализируют обычным способом рестрикционным ферментным анализом Отбирают плазмиду с EcoRI-Hindlll фрагментом ЗООЬр н используют в качестве клонирующего вектора для добавления 3 участка 1рр гена.

Около 2 мкл плазмиды выжигают в 50 мкл Sail рестрикционного буфера (150 мМ NaCl, 6 мМ Tris НС1, рН 7,9; 6 t MgClj , 6 i р -меркаптоэтанола) с 2 ед. Sail в течение часа при 37°С, а затем разбавляют до 150 мкл в BamHI буфере, содержащем 2 ед. BamHIo Спустя час при добавляют 2,5 едо щелочной фосфатазы, а затем продолжают инкубирование в течение часа при 65°Со Материал экстрагируют смесью фенол/СНС1, осаждают этанолом, растворяпот в TEN и используют в качестве клонирующего вектора для фрагмента 1рр 3 .

Для получения фрагмента, содержащего 1рр 3 участок, 10 мкг pKENIII выжигают в 100 мкл Hpal буфера (20 мМ KCli 10 мМ Iris НС1, рН 7,4; 10 tM MgCl и 6 мМ рз-меркаптоэтано- ла) с 10 ед. Hpal в течение 2 ч при

. Послг; экстр.11ЧФС1ВЛИМП смггьк фенол/CF.Cl т, и осаждрния г тлиолом ДНК растворяют в 10 мкл Т4 ДНК ли- газиого буфера, содержап1его 20 пм1)ль фосфорилирова}1ного Sail линкера (5 GGTCGACC З ) и 2 ед, 14 ДНК лигазы, а затем инкубируют в течение 16 ч при , Лигазу инактивируют, нагревая при 65°С в течение 10 мин. Нолученньй материал разбавляют до 100 мкл в Sail буфере, содержащем 10 ед. Sail, инкубируют в течение часа при , а затем разбавляют

до 300 мкл в PVUII буфере (60 мМ NaGl, 6 мМ Tris.HCl, рН 7,5; 6 мМ MgClj,,6 мМ Ъ-меркаптоэтанола) , со- держаг;ем 10 ед. PVUII рестрикционного фермента. Спустя час при

ДНК фракционируют на 5%-ном полиак- риламидном геле. Приблизительно 0,5 мкг 950Ьр фрагмента выделяют, очищают и растворяют в TEN. 0,02 мкг фрагмента разбавляют в 20 мкл Т4 ДНК

лигазного буфера, содержащего 20 пмоль фосфорилированного BamHI линкера (5 CCGGATCCGG3 ) и 2 ед. ТА ДНК лигазы, а затем инкубируют в течение 16 ч при . Полученную ДНК нагревают в течение 10 мин при , разбавляют до 100 мкм BamHI буфером, содержапим 20 ед, BamHI, инкубируют в течение 2 ч при 37 С, а затем фракционируют на 5%-ном полиакриламидном геле до удаления избытка линкерных молекул. Полученный 950Ьр фрагмент, содержащий BamHI и Sail липкие концы, обычным способом очищают и растворяют в 20 мкг ТА ДНК лигазного буфера,

содержащего 0,2 мкг клонирующего вектора, описанного ранее, и 0,2 ед. Т4 ДНК лигазЫо После инкубирования в течение 16 ч при 4°С ДНК используют для трансформирования E.coli К12 НВ101. Плазмиды получают из устойчивых к ампициллину трансформаторов и обычным способом анализируют на наличие Sall-BamHI фрагмента. Целевую плазмиду ( -5,2kb) обозначают pKEN021o

10 мкг PKEN021 выжигают при в 200 ккл Xbal/BamHI буфера (150 NaCl, 10 мМ Tris НС1, рН 8; 10 мМ MgClgf 6 мМ -меркаптоэтанола), используя 10 ед. BamHI в течение часа, а затем 10 ед, Xbal еще в течение

часа при . Целевую Xbal-BamHI выжженную ДНК обрабатывают затем 2,5 ед, щелочной фосфатазы в течение 1,5 ч при 65 С, экстрагируют

7

смесью фенол/сне 1 в,, осаждают этанолом и растворя 1Т в 50 мкл TEN для дальнейшего использования.

Плазмиду ptrpED50chGH800 используют в качестве источника ДНК фермета, содержащего кодирующую последовательность для части гена гормона роста человека. Генная часть плазми ды ptrpED.SOchGHSOO человеческого гормона роста содержит уникальный ,Smal рестрикционный сайт на бЬр после трансляционного терминационного кодона гена о Этот сайт заменяют на BamHI сайт, используя нижеследующую методику: 6 мкг плазмиды выжигают 6 ед. Sinal в 200 мкл Smal рестрик- ционного буфера (15 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 6 мМ MgClii,.15 мМ КС1 и 6 м Р -меркаптоэтанола) в течение 1,5 ч при . После завершения выжигани осуществляют экстракцию смесью фе- яол/СНС1з, выделяют ДНК, осаждая этанолом, а затем растворяют в 24 м

TEN, 40«пмоль фосфорилированного BamHI адаптерного фрагмента добавляют к 0,5 мкг (0,2 пмоль, концы) выжженной описанным выше способом плазмиды в 16 мкл лк1азного буфера, содержащего 2 ед., Т4 ДНК лигазыо Полученную смесь инкубируют в течение 2 ч при , 16 ч - при , а затем 10 мин при 65°С. BamHI липкий конец получают обычным выжиганием BamH рестрикционным ферментом Фермент расщепляет линкерную последовательность так же, 1Сак BamHI сайт, расположенный в начале клонированной кДНК последовательности человеческого гормона роста Это дает 691Ьр фрагмент с липкими BamHI концами, который выделяют сначала на 6%-ном поли- акриламидном геле, а затем - обычным способом Выделенный ДНК фрагмент лигируют (используя 0,2 ед. Т4 ДНК лигазы в 20 мкл буфера в описанных ранее условиях) с 0,2 мкг BamHI,

8

0

5

0

5

0

5

0

5

выжженной и обработанной щелочной фосфатазой pBR322. Спустя 16 ч при 4 С полученный материал используют для трансформирования E.coli штамм JA221/NRRZD-15014). Трансформанты отбирают на агарных пластинах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, затем обычным способом выделяют плазмиды, и дентифицируют рестрикционным ферментом и анализируют с помощью гель-электрофореза. Целевые плазмиды, обозначенные .pNM575, содержат BamHI фрагмент (приблизительно 700Ър), их размножают обычным способом для дальнейшего использования.

ДНК последовательность зрелого человеческого гормона роста содержит один FnuDII сайт, который составляет 47Ьр из первого нуклеотида. 25 мкг pNM575 выжигают в 250 мкл BamHI буфера с 25 ед BamHI прн в течение часа 691Ьр фрагмент с BamHI липким концом обычным способом изолируют из 6%-ного полн- акриламидного геля и очищают. После очистки фрагмента одну треть его (эквивалент 8 мкл плазмиды) выжигают в 100 мкл FnuDII буфера (6 NaCl, 6 мМ Tris НС1, рН 7,4; 6 tiH MgCla, 6 мМ р)-меркаптоэтанола) с 2,5 ед FnuDII в течение 1,5 ч при 37 с. Электрофорез на 6%-ном поли- акриламидном геле и стандартная методика выделения дают возможность выделить 538Ьр ДНК фрагмент, содержащий кодирующую последовательность для последних 175 аминокислот гена с последующим трансляционным стоп- сигналом.

Двухнитевой ДНК фрагмент синтезируют фосфотризфирным способом для присоединения 1рр промоторного участка с кодирующим участком гормона роста человека.

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и касается способа конструирования рекомбинантных плазмидных ДНК, кодирующих синтез бычьего или человеческого гормона роста. Цель изобретения - повышение выхода метиолинового гормона. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК путем объединения BAM H 1 - XBA 1 или BAM H 1 - ECOR 1 фрагмента плазмиды PC4101 с XBA 1 - BAMH 1 фрагментом плазмиды PNM 789в с BAM H1-FNU2 фрагментом плазмиды PNM575. Дополнительно к полученной рекомбинантной плазмидной ДНК можно присоединить ECOR1-CLA1 фрагмент плазмиды PNM 608. 2 табл.

5 СТА&АССВТАТТААТААТСТТСССАТТССАТ&АТОАТСАТААСТТСССАА, rfffflll ll fflllT « flMlt ltflfI llftll lit

3 ТСССАТААТТАТТАСААСССТААССТАСТАСТАСТАТТСААО&ВТТ- ССАТТСССТТАТССАСССГГТТТСАСААСОСТАТССТССО З ЬШОП

I I 1 1 I I I I I 1 I I f I t т f I I 11 I f И t I Ч1 111J., el

CCTAACCCAATAGGTCC&AAAAACTGTTGC&ATAC&AG&C 5

Получаютследующие сегмечты:

f)CTAGAGGGTAT

2)TAATAATGTTCC

3)CATTGGATGAT

4)GAT GAT A A GTT С С

5)CAACCATTCCC

6)TTATCCAGGC

7)TTTTTGACAACG fi)CTATGCTCCG

9)САТТАТТААТАССГТ

fO)ATGGGAA

П)CTTATCATCATCCA

f2)GGTTGGGAA

f3)GGATAAGGGAAT

14)GTCAAAAAGCCT

/5) CGGAGCATAGCGTT

Используя полученные описанным выше способом сегменты, реакцию присоединения, катализируемую ТА лига- зой, осуществляют поэтапно:

a)5 -нефосфорилированный сегмент 1 присоединяют к 5 -фосфорилир ванному сегменту 2 в присутствии 5-фосфорш1ированного сегмента 9, используя ТА лигазу для получения ДНК дуплекса 1. Дуплекс выделяют препаративным гель-электрофорезом на 15%-ном полиакриламиде;

b)5 -фосфорилированный сегмент 3 присоединяют к 5 -фосфорилирован- ному сегменту А в присутствии 5 - фосфорилированного сегмента 11, используя ТА лигазу для получения ДНК дуплекса 2, который очищают на 15%- ном полиакриламидном геле с помощью электрофореза;

c)5 -фосфорилированный сегмент присоединяют к 5 -фосфорнпированно- му сегменту 6 в присутствии 5 -фос- форилинованных сегментов 12 и 13, используя ТА лигазу для получения ДНК дуплекса 3, который очищают с помощью электрофореза на 15%-ном полиакриламидном геле;

d)5 -фосфорилированный сегмент присоединяют к 5 -фосфорилированно- му сегменту 8 в присутствии 5 -фосфорилированного сегмента 1А и 5 -не фосфорилированного сегмента 15, используя Т4 лига-эу для оОрлзонаиня ДИК дуплекса 4, котор)П( очшнлют элек - трофорезо )(л полилкрпламид- ном геле;

e)ДНК дуплексы 2,3 н А соединяют затем вместе ТА лигазой до образования ДНК дуплекса 5, который очищают с помощью электрофореза на

0 15%-ном полиакриламидном геле;

f)5 -фосфорилированный сегмент 10 и ДНК дуплекс 5 добавляют в присутствии ТА лигазы к ДНК дуплексу 1. Полученный ДНК дуплекс очи5 щают с помощью электрофореза на 15%-ном полиакриламидном геле. Затем ДНК дуплекс ферментатквно фосфо- рилируют, используя ТА полинуклеотид- киназу и ( к ) АТР в соответствии -.

0 с установленной методикой,

Экспрессионную плазмиду PNM702 конструируют ферментативным присоединением 0,1 пмоль (О,А мкг) Xbal- BAmHI фрагмента плазмиды pKEN02l,

5 0,025 пмоль синтетического ДНК фрагмента и 0,3 пмоль (0,08 мкг) 538Ьр фрагмента в 24 мкл лигирующего буфера, используя 1,5 ед. ТА ДНК ли- газЫ; После инкубирования в течение

0 16 ч при полученную смесь используют для трансформирования E.coli JA221, как было описано ранее, Трансформанты отбирают на агарных пла с- тинах, содержащих 100 мкг/мл ампицилли

5 на, и обычным способом культивируют в качестве предпочтительного источника целевой плазмиды экспрессии.

Экспрессию человеческого гормона роста определяют по стандартной ме0 тодике радиоиммуноанализа. При определении она составляет по кр 1йней мере, 2 млн о молекул на клетку.

Плаэмиду рШ702 экспрессии человеческого гормона роста используют

5 в качестве исходного материапа при конструировании плазмиды, экспрес- сирующей Me t-Phe-Pro-Zeu-Asp-Asp-Asp- -Asp-Jys-bGH.

Плазмиду рВКЗАВ используют в каQ честве источника двух фрагментов ДНК, содержащих кодирующую последовательность для части гена бычьего гормона роста„ Плазмида содержит 831Ьр бычий гормон роста - кодируюс щую последовательность, клонированную в PstI регтрикционный сайт PBR322.

10 мкг pNM702 частично выжигают 1 ед. PVU1I в 200 мкл PVUII рестрикционного буфера (60 мМ NaCl, 6 мМ Tris НС1, рН 7,5; 6 мМ MgClj, 6 мМ р -меркаптоэтанола) в течение 10 мин при . После прекращения реакции нагреванием в течение 10 мин при ДНК материал обрабатывают щелочной фосфатазой и выделвтют фрагменты на 1%-ном агароэном геле. Линейный ДНК фрагмент размера, соответ ствующего ДНК без А97Ьр PVUlI фрагмента (выходит несколько раньше, чем плазмида с одним разрывом), обычным способом выделяют, очищают и используют при конструировании промежуточ- ной плазмиды.

Фрагмент 494Ьр PVUII плазмиды pBR3A8 получают выжиганием 10 мкг плйзмиды в 200 мкл pVTJII буфера, содержащего 10 ед. pVUII, в течение часа при . Эти фрагменты вьаделя- ют на 6%-ном полиакриламидном геле, целевой 494Ьр обычным способом проявляют и очищают о

Промежуточную плазмиду конструируют, осуществляя взаимодействие 0,2 мкг плазмиды pNM702 PVUII фрагмента с 0,05 мкг 494Ьр фрагмента в 20 мкл Т4 ДНК лигазного буфера, содержащего 2 едо Т4 ДНК лигазы, в течение 16 ч при о После трансформации и селекции трансформантов на устойчивость к ампициллину плазмиды обычным способом анализируют на присутствие и соответствующую ориентацию 494Ьр PVUII фрагмента, Плазмиды с 494Ьр PVUII фрагментом и 440Ьр Xbal-Smal фрагментом отбирают для

XbOl

5 СТАСАСССТАТТААТААТ&ТТСССАТТССАТСАТ&АГ&АТААС- ,I I I I I I t г г I г ( I I I г t I f г I If I I t г I I I t г t I г I I I f

3TCCCATAATTATTACAAC6CTAACCTACTACTACTATTCTTCCCAGCCAT&TCCTTCTC

M M I I M M I I t I I I I I I I

Д А(;еСТС&&ТАСАСаААСАССС

При получении 63bp фрагмента приготавливают следуюпще 9 сегментов:

CTACAGCGTAT

TAATAATGTTCC

CATTCGATCAT

GATGATAAGTTCC

CAGCCATGTCCTTGTC

5

0

5

0

5

использования при дальнейшем конструировании.

10 мкг промежуточной плазмиды выжигают 1 еДо PVUII в 200 мкл PVUII буфера в течение 5 мин при 37 С„ После нагревания в течение 10 мин при 65 С полученную смесь распределяют на 1%-ном агарозном геле, выделяют линейную ДНК, имеющую только один единичный PVUII разрьш на молекулу, и очищают Вьщеленный материал (приблизительно 3 мкг) полностью выжигают 5 еДо Xbal и обрабатывают щелочной фосфатазой. Эти фрагменты распределяют на 1%-ном агарозном геле, самый больгаой из них (потерявший 109Ьр фрагмент между Xbal и первь1м сайтом PVUII в человеческом и бычьем гормоне роста) выделяют обычным способом.

ДНК последовательность для первых 23 аминокислот (69Ьр) бычьего гормона роста до первого PVUII сайта содержит 2HpaII рестрикционных сайта, первый из которых расположен на 23Ьр от первой нуклеотиды кодирующей последовательности. бЗЬр фрагмент синтезируют фосфортриэфирным способом. Этот первый фрагмент соответствует 19Ьр последовательности от Xbal сайта в 1рр рибосомном связывающем сайте через АТС-трансляционный стартовый сигнал с последующей кодирующей последовательностью для Phe- -Pro-Zeu-Asp-Asp-Asp-Agp-Zys (24bp) и 20 нуклеотидами кодирующей последовательности бычьего гормона роста (от Phe до первого Hpall сайта) и имеет следующую последовательность:

jr Hpaii

5

6) ATGGGAACATTATTAATACCCT T) ГТАТСЛТСАТСАГССА

8)ATG(JCTGGUAA(

9)CGG-ACAAGC AC

Используя приготовленные ранее сегменты, осуществляют поэтапное прсоединение, катализируя процесс Т4 лигазой:

13

a)5 -нефосфорилированный сегмент I присоединяют к 5 -фосфори- лированному сегменту 2 в присутстви 5 -фосфорилированного сегмента 6, используя ТА лигазу для образования ДНК дуплекса 1, который очищают элетрофорезом на 15%-ном полиакрипамид ном геле;

b)5 -фосфорилированные сегменты 3,4 и 5 соединяют в присутствии 5- фосфорилированного сегмента 9, используя Т4 лигазу для получения ДНК дуплекса, который очищают с помощью электрофореза на 15%-ном полиакрил- амидном геле Затем ДНК дуплекс фер ментативно фосфорилируют, используя

Т4 полинуклеотидную киназу и () ATP с последующей стандартной процедурой.

ДНК фрагмент 46Ър, который простирается от описанного Hpall сайта до PVUII сайта, можно сконструировать синтетически или получить из исходной рВНЗ 48 плазмиды; 100 мкл плазмиды pBR348 выжигают в 400 мл PVUII буфера (50 ед„ PVUII) в течение 2 ч при После фенольной экстракции и осаждения этанолом ДНК растворяют в 400 мкл PstI буфера (50 ь NaCl, бмМ Tris HCl, рН 7,4; 6 t MgCli, 6 мМ (Ь-меркаптоэтанола) с 50 ед. PstI в течение 2 ч при . ДНК фрагменты распределяют на 6%-но полиакрипамидном геле, 135 фрагмент содержащий целевую 46Ьр последовательность, выделяют и очищают стадартными способами. Одну треть выделенной ДНК (эквивалентно 33 мкг) подвергают ограниченному выжиганию 1 ед. Hpall рестрикционного фермент в 100 мкл Hpall буфера (20 М Tris НС1, рН 7,4; 7 мМ MgClQj 6 мМ Ь-меркаптоэтанола) в течение 40 мин при 37°С. После нагревания при 65 С в течение 10 мин ДНК фрагменты помещают на 5%-ный акрнпамидный гель (акриламид:бис отношение 19:1) вместе с соответствующим маркером размера. Целевой 46Ьр фрагмент, полученный Hpall частичным вьокиганием 135Ьр фрагмента, очищают стандартны способом.

0,2 мкг Xbal-PVUIl фрагмента пла мидного вектора, 3,2 пмоль синтетического бЗЬр фрагмента и 0,5 пмоль 46Ьр фрагмента инкубируют в 10 мкл лигирующего Йуфера с 2 ед„ Т4 ДНК лигазы в течение 16 ч при . Лиги

5

0

5 0 г 0

5

0

5

I 4

рую1чую смесь используют для трансформации E.coli JA221, Полученные трансформанты, которые содержат целевую плазмиду рШ789, отбирают на устойчивость к ампициллину. Идентичность с плазмидой pNM789 подтверждена обычным скринированием на наличие 494Ър PNII и 109Ьр Xbal-PVUII фрагментов .

Плазммда рШ789 требует изменения одного аминокислотного кодона для полного превращения в бычий гормон роста, что осуществляют удалением 28Ьр PVUII до BamHI фрагмента рШ789 и заменой синтетическим двухнитевым фрагментом, имеющим следующую после- . довательность:

5 CTGTGCCTTCTAC 3

3 GACACGGAAGATCCTAG 5

10 мкг pNM789 выжигают 1 ед, PVU1I в 200 мкл PVUII буфера в течение 5 мин при 37°С. После нагревания в течение 10 мин при 65°С полученную смесь разбавляют до 300 мкл с добавлением BamHI буфера, выжигают до за- верщения 10 ед. BamHI в течение часа при , обрабатьшают 5 ед. щелочной фосфатазы и инкубируют в теме- ние часа при 65°С. ДНК фрагменты разделяют на 1%-ном агарозном геле; ДНК фрагмент размером плазмиды pNM789 с единичным разрывом очищают обычным способом. 0,02 мкг этого фрагмента лигируют 5 пмоль синтетического фрагмента, используя.2 едо Т4 лигазы в 20 мкл лигазного буфера. Лигирование осуществляют в течение ночи при . После трансформации несколько плаз- мид вьщеляют и скринируют на соответствующие PVUII (494bp) и Xbal- Bamll (628bp) фрагменты. Плазмиды, содержащие указанные выше фрагменты, составляют целевую плазмиду pNM789B.

Пример 2. Бактерию E.coli K12/pIM-l -A3/NRRI.B-15733) культивируют в TV бульоне (1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлористого натрия; рН 7,4) с 30 мкг/мл канамицина при 25°С в соответствии с обычной микробиологической процедурой. После этого культуру разбавляют 1:10 в свежем бульоне, после трех часов инкубирования при ,5 нл культуры переносят в 1,5 мл ампулу Эппендорфа и центрифугируют в течение с. Если нет других указаний, все манипуляции осуществляют при комнатной температуре. Полученную над- .

осадочную жидкость осторожно удаляют аспиратором с острым концом. Клеточную массу повторно суспендируют в «МОО мкл свежеприготовленного лизо- цимного раствора (2 мкг/мл), который содержит 2 мкг/мл лизоцима, 50 М глюкозы, 10 мМ ЕТДА (диаминтетрааце- тат) и 25 1 Tris-HCl, рН 8. Добавляют -200 мкл щелочного SDS (натрий- додецнлсульфат) раствора (0,2 NaOH, 1% SDS) и осторожно переворачивают ампулу, а затем выдерживают при 0°С до завершения лизиса (примерно 5 мин). Затем добавляют мкл 3 М натрийацетата и осторожно смешивают содержимое ампулы, переворачивая ее в течение нескольких секунд,

-Ампулу выдерживают при 0°С в течение по крайней мере 60 мин, а затем центрифугируют в течение 15 ми до получения почти прозрачной над- осадочной жидкости, Надосадочную жидкость переносят во вторую ампулу центрифуги, в которую добавля- ют 3 объема холодного 100%-ного этанола. После выдерживания ампулы на смеси сухой лед - зтанол в течение 5 мин полученный осадок собирают центрифугированием (5 мин), надоса- дочную жидкость удаляют отсасыванием Собранную массу растворяет в 100 мкл ТЕ (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЕДТА Получают целевую ДНК рШ-Х -A3 плаз- миды.

Около 5 мкл.плазмиды pNM789B-ДНК в 50 мкл HiSalt буфера инкубируют с 10 ед. каждого (BamHI и Xbal) рес- трикциоиного фермента при 37°С в те- чение 1 ч. После доба вления 5 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 8,0) ДНК осаждают 3 объемами 100%-иого этанола. Целевой ДНК диджест растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при 0°С для дальнейшего использования.

5 СТАСА&6&ТАТТААТА АТС , GA6 CAT CAT ТАА АТС ТТС CCA ССС . м г и I I I I I I f f t I I III III trr HI (II III t«, fIT -

TCCCATAATTAT TAG AAC. GTC СТА СТА

Ш

TAG AAC- OGTi

cek

H

TCC CCC СТС TTT CGC AAC CGT CTCCT III III I I I III III III III I ACC CCC CAG AAA CCC TTC CCA G

Целевую линкерную последовательность синтезируют обычным модифицированным фосфотриэфирным способом.

Около 200 пмоль ДНК линкера примера 3, 1 мкг плазмиды pCZlOl

Около 1 мкг вьтарки плазмиды pIM-l -A3, 1 мкг выпарки плазмиды рММ789В Xbal-RamHI, АО мкл воды, 5 мкл (5 мМ) АТП, 5 мкл лигирующей смеси и 5 ед. Т4 ДНК лигазы инкубируют при 20 С в течение ч. После инкубирования при 65 С в течение 2 мин с последующим клонированием н льду полученную смесь лигирования используют дпя трансформации K12RV308 на TV пластинах (1% трип- тона, 0,5% дро окевого экстракта, 0,5% хлористого натрия, 1,5% агара, рН 7,4), содержащих 50 мкг/мл кана- мицина.

Некоторые из полученных трансформантов (что можно легко показать обычным электрофорезом на агарозном геле и другими тестами) содержат только целевую 10,8kb плазмиду. Получеиные клетки используют для выделения плазмиды pCZlOl,

Пример 3. Целевой фрагмент конструируют практически по способу примера 2, за исключением того, что вместо плазмиды pNM789B используют плазмиду pCZlOl. Целевой 10,2kb BamHI-Xbal рестрикционный фрагмент обычным способом выделяют и изолируют с помощью электрофореза на агарозиом геле, затем растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при дпя дальнейшего использования.

Целевой фрагмент конструируют по способу примера 2 за исключением того,- что вместо плазмиды рШ789В и Xbal рестрикционного фермента используют плазмиду pCZlOl и HgiAI рестрикционный фермент. Целевые ,6kb BamHI-HgiAI рестрикционные фрагменты выделяют обычным способом с помощью электрофореза на агарозном геле, затем растворяют в мкл ТЕ буфера и хранят при для Дальнейшего использования.

АТС ТТС CCA ССС III t«, fIT -

TAG AAC- OGTi

cek

H

3 5

55 ,2kb BamHI-Xbal фрагмента н 0,5 мкг плазмиды pCZlOl ,6kb BamHI-HgiAI фрагмента лигнруют, полученную плазмиду нспользуют дпя

трансформирования E.coli KI2 RV308 по способу примера 2.

Некоторые из полученных трансформантов (что легко показать с помощью электрофореза на агарозном геле и других тестов) содержат только целевую л-10,8kb плазмиду. Такой транс формант, обозначенный E.coli K12RV308/pCZnA, отбирают, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют в соответствии с обычными микробиологическими методиками. Как было показано с помощью SDS гельTACAGCCTATTAATA

I т I F I f I 1 т т 1 г

ТСССАТААТТАТ

&СС АТС Iff f I I CC& TAG

ТСС TTG I 11 f f I AC& AAC

АТС f f I TAG

TCC f r r AG&

Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12-RV308/pCZ101,1, помещают на TV ara p, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют. Выделяют плазмиду pCZlOl,. Как показано с помощью SDS гель-электрофореза, RLA и других тестов, трансформанты осуществляют экспрессию met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZlOl, содержит термоиндуцируемый репликон ускоренного роста, максимальная экспрессия met-bGH происходит при культивировании при температуре .

Пример 5. Плазмида pGMI содержит E.coli триптофановый опе- рон, содержащий исключение AZE1413. Следовательно, экспрессирует литый протеин, содержащий первые 6 аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE полипептида (здесь и далее для краткости обозначаемого ZE ), а также trpD полипептид целиком (все под контролем trp промотор/операторной системы).

Около 20 мкг плазмиды выжигают рестрикционным ферментом PNIIII, который расщепляет плазмиду по 5 сайтам. Генные фрагменты объединяют EcoRI линкерами, состоящими из самокомплементарных лигонуклеотидов последовательности pCATGAATTCATG, обеспечивая EcotlT сайт расщепления для последующего, клонирования в плазмиду, содержащую EcoRI сайт.

13)13

электрофорет., KIA и друпгх тсслчш, полученные клетки экспргсг.иропали met-bCH в болы юм количество. Так как плазмгда р(;7,114 содержит термо- нндуциронанньп репликон ускоренного роста, максимальная экспрессия met- ЬГтН наблюдается при температуре выращивания культуры около 37 С.

дПример А. Целевое конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 3 с тем отличием, что вместо линкерной последовательности примераЗ используют последова15 тельность

ССА ТТО CAT CAT CAT ТАА АТС TTC ... ,(t r t f f t f I tit f t r . I I f GGT AAC СТА СТА СТА ATT TAG AA&

CTC TTT CCC AAC CCT CTCCT 3

I I r I t f t I f f f 1 r r f I f f t .

GAC AAA CCC TTC CCA С 5

20 мкг ДНК фрагментов, полученных из pGMI, обрабатывают 10 ед, Т4 ДНК лигазы в присутствии 200 пмоль 5 -фосфорилированного синтетического лигонуклеотида pCATGAATTCATC и 20 мкг Т4 ДНК лигазного буфера

(20 мМ Tris, рН 7,6; 0,5 мМ АТР,

10 мМ MgClj, 5 мМ дитиотретиола) при в течение ночи. Затем раствор нагревают в течение 10 мин при для остановки лигирования. Линкеры

расщепляют EcoRI выжиганием, фрагменты (теперь уже с EcoRI концами) выделяют, используя 5%-ный полиак- рнламидный гель-электрофорез„ Три самых крупных фрагмента вьщеляют из

геля, вначале окрашивая этидкумбро- мидом, затем определяя положение фрагментов под действием ультрафиолетового излучения и выражая из гег ля участки, представляющие интерес.

Каждый из фрагментов геля с 300 мкл 0,1хТВЕ помещают в камеру для диализа и подвергают электрофорезу при 100 F .в течение часа в 0,1 хТВЕ буфере (ТВЕ буфер содержит

10,8 г Tris основания, 5,5 г борной кислоты, 0,09 г NajEATA в I л ). Водный раствор выбирают из камеры, для диализа, экстрагируют фенолом, хлороформом и доводят до 0,2М по

отнощению к хлористому натрию. Затем ДНК выделяют в воде после осаждения этанолом. Фрагменты, содержащие trp промотор/оператор с EcoRI липкими концами, идентифицируют путем включения в чувствительную к тетрациклину плазмиду, которая после включения промотор/оператора становится устойчивой к тетрациклину.

Все выделения ДНК фрагмента, описанные здесь и далее, в этом примере осуществляют с применением PAGE последующим электроэлюированием, описанным выше.

Плазмида pBRHI экспрессирует устойчивость к амипициллину и содержи ген устойчивости к тетрациклину, но так как в ней нет связанного промотора, не экспрессирует эту устойчивость. Клетки, в которых находится плазмида, соответственно, являются чувствительными к тетрациклину. Если ввести промотор/операторную систему в EcoRI сайт, плазмида будет экспрессировать устойчивость к тетрациклину.

Плаэмиду pBRHI дигерируют EcoRI. Фермент удаляют, экстрагируя фенолом, а затем хлороформом. ДНК повторно суспендируют в воде после осаждения этанолом. Полученную ДНК в отдельных реакционных смесях объединяют с каждым из трех ДНК фрагмен тов, полученных в примере 5, и лиги руют с ТА ДНК лигазой, как было описано ранее. ДНК, присутствующую в реакционной смеси, используют дпя трансформации компетентной E.coli K12294/NPPZB-15625/ с помощью.стандартной методики, затем бактерий помещают на пластины ZB, содержащие 20 мкг/мл ампициллина и 5.мкг/мл тетрациклина.

Отбирают несколько устойчивых к тетрациклину колоний, вьщеляют плазмидную ДНК и обозначают pBRHtrp Наличие целевого фрагмента подтверждается рестрикционным ферментным анализом. Плазмидный pBRHtrp экспресирует fo -лак тамазу, придает устойчивость к ампициллину и содержит ДНК фрагмент, который включает trp промотор/оператор. ДНК фрагмент также кодирует первый протеин (обозначенный ZE), содержащий сшивку первых шести аминокислот trp лидера и приблизительно последнюю треть trpE полипептида; второй протеин (обозначенный D), соответствующий приблизительно первой половине trpD полипептида, и третий протеин, кодирующий ген устойчивости к тетрациклину.

Плазмиду pBRHt-.rp выжигают EcoRI

рестрикционным ферментом. Полученный фрагмент, выделенный с помощью PAGE и электроэлюирования, объединяют с EcoRI, выжженной плазмидой pSOMII. Полученную смесь лнгируют Т4 ДНК

лигазой, полученную ДНК трансформируют в E.coli К12 294, как было описано ранее. Трансформантную бактерию выбирают на пластинах, содержащих ампициллин. Полученные колонии

устойчивые к ампициллину, скриниру- ют путем гибридизации. Фрагмент, содержащий trp промотор/оператор, выделенный из pBRHtrp, а затем меченный радиоактивно Р , используют

в вышеописанной процедуре в качестве зонда. Некоторые положительные при гибридизации колонии отбирают. Выделяют плазмидную ДНК. Ориентацию вставленных фрагментов определяют

рестрикционным анализом, используя

ферменты Bglll и BamHI в двойном выжигании Колонии, содержащие целевую плазмиду с фрагментом trp промотор/ оператор в соответствующей ориентации, выращивают на ZB среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина. Целевую плазмиду обозначают pSOM7A2 и используют для последующих конструкций, описанных далее.

Плазмиду pSOM7&2 выжигают Hindlll, а затем лямбда-экзонуклеазой (5 до 3 экзонуклеаза) в условиях, выбранных так, чтобы выжигание произошло позади Bglll рестрикционного сайта

внутри ZE кодирующего участка. Около 20 мкг Hindlll выжженной pSOM742 растворяют в буфере (20 мМ глицин- ного буфера, рН 9,6; 1 мМ MgCli, 1 мМ р -меркаптоэтанола) . Полученную

смесь обрабатьшают 5 ед. лямбда-экзо- нуклеазы в течение 60 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь, полученную при этом, экстрагирук т фенолом, хлороформом и осаждают этаНОЛОМ,

Дпя получения EcoRI остатка у дистального конца ZE генного фермента синтезируют праймер рССТСТССАТСАТ усовершенствованным фосфотриэфирным способом и гибридизнруют с однони- тевым концом ZE генного фрагмента, полученного при выжигании лямбда- экзогеназой. Гидридиэацию проводят, растворяя 20 мкг обработанного лямб-

да-экэогеназой дят, растворяя

Гибридизацию прово- 20 мкг обработанного лямбда-экзогеназой продукта выжигани Hindlll плазмиды pSOM742 в 20 мкл HjiO и объединяя с f мкл раствора, содержащего 80 пмоль 5 -фосфорили- рованного олигонуклеотида, описанного ранее о Синтетический фрагмент гибридизируют с З концом ZE кодирующей последовательности, а остальную однонитевую часть ZE фрагмента заполняют полинеразой Кленова 1, используя dATP, dTTP, dCTP и dCTP. Полимераза Кленова I является фрагментом, полученным при протеолити- ческом расщеплении ДНК полимеразы I Она соде.ржит 5-3 полимеризующуто активность, З - 5 экзонуклеотичес- кую активность, но не 5 -З экзо- нуклеотическую активность исходного фермента.

Затем реакционную смесь нагревают до и оставляют медленно остывать, после чего до бавляют 4 мкл фермента Кленова. После инкубирования 15 мин при комнатной температур затем 30 мин при реакцию останавливают, добавляя 5 мкл 0,25 М ЕДТА, Реакционную смесь экстрагируют фенолом, хлороформом и осаждают этанолом. ДИК последовательно расщепляют рестрикционным ферментом Bglll. Полученные фрагменты разделяют PAGE. Ауторадиограмма, полученная для геля, выявляет меченый Р фрагмент ожидаемой длины приблизительно 470Ьр, который выделяют электроэлюированием. Фрагмент ZE /d имеет Bglll терминус и тупой конец, кодирующий начало праймера.

Плазмиду рТЫ1 конструируют путем включения синтетического гена тимо- зин-сУ 1 в плазмиду pBR322. Синтез тимозин-0 1 кодирующей ДНК включает синтез и последующее лигирование 16 олигонуклеотидов (Т -T,b)raet. АТС включают по N-термонулу, 5 концы снабжают однонитевым липким концом дЛя облегчения присоединения плаз- мид расщепленных EcoRI и BamHI. Как легко видеть, Bglll сайт в центре гна помогает анализу рекомбинантных плазмид.

Олигодеоксирибонуклеотиды Т синтезированные модифицированным фосфотриэфирным способом, представлены в табл. 1.

Полностью злгпищенные тридеокси0

5

0

0

рибонуклеотиды Д (8Ь мг, 0,05 ммоль) и 2 (180 мг, 0,1 ммоль) деблокируют по 5 гидооксилам путем обработки 2%-ным BSA в 7:3 (объем/обьгп) хлороформ/метанол (10 и 20 МП соответственно) в течение 10 мин при . Реакции останавливают, добавляя насыщенный водный бикарбонат аммония (2 мл) , материал экстрагируют формом (25 мл) и промывают водой ( мл). Органические слои сушат (над сульфатом магния), концентрируют до небольпих объемов (около 5 мл) и осаждают, добавляя петролейный эфир (фракцию ЗЗ-бО С). Бесцветные осадки собирают центрифугированием и сушат в иксикаторе в вакууме до получения 6 и 8 соответственно (каждый гомогенный) в помощью TLC на силикагеле.

Тримеры 1 и 3 (270 мг, 0,15 ммоль; 1А5 мг, 0,075 ммоль) превращают в 5 их фосфодиэфиры (5 и 7) обработкой смесью триэтиламин/пиридин/вода (1:3:, объем/объем, 10 мл) в течение 25 мин при комнатной температуре. Реагенты удаляют в роторном не- парителе. Остатки сугаат повторным вьтариванием с безводным пиридином (ЗиЮ мл) о Тример 8 (0,05 ммоль) и тример 7 объединяют с TPST (50 мг, 0,15 ммоль) в безРводном пиридине (3 мл). Реакционную смесь оставляют в вакууме при комнатной температуре в течение 2 ч. Анализ TZC показьша- ет, что 95% гримера 8 превращено в гексамерный продукт (визуализированный по определению ДМТ группы путем опрыскивания 10%-ной водной серной кислотой и нагревания при бО С). Реакцию гасят, добавляя воду (1 мл). Растворитель вьтаривают в вакууме при пониженном давлении. После удаления пиридина совместным испарением с толуолом гексамер деблокируют по 5 положению 2%-ным BSA (8 мл), как описано ранее для тримеров 4 и 2. Продукт (10) очищают на колонке с силикагелем (Merkc 60 Н, 3,55 см) поэтапным градиентным элюированием смесью хлороформ/метанол (98:2 - 95:5, объем/объем). Фракции, которые содержат продукт 10, выпаривают досуха о Аналогично тример 3 объединяют с 6. Полностью защищенный продукт непосредственно очищают на силикагеле. Последнее соединение деблокиру5

0

5

0

5

231491346

ют по З концу смесью триэтиламин/ пиридин/вода, как описано ранее до получения фрагмента 9.

Гексамеры 9 и 10 объединяют в , безводном пиридине (2 мл) сTPSTe (75 мг, 0,225 ммоль) в качестве конденсирующего агента. После завершения реакции(4 ч, комнатная температура) полученную смесь вьтаривают |0 в роторном испарителе, а остаток хроматографируют на силикагеле„ Продукт II (160 мг), полученный осаждением петролейньи эфиром, оказывается гомогенным по данным TZC, Часть 15 соединения 11 (20 мг) в пиридине (0,5 мл) полностью деблокируют, обрабатывая концентрированной гидроокисью аммония (7 мл, 8 ч, ), а затем обрабатьгаают в 80%-ной ук- 20 сусной кислоте (15 мин, комнатная температура). После выпаривания уксусной кислоты твердый остаток растворяют в 4%-ной водной гидроокиси

24

Т4 ДНК лигазой. Продукт реакции очищают гель-электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевины. Четыре вьщеленных продукта лигируют вместе, реакционную смесь разделяют с помощью электрофореза на 10%-ном полиакриламидном геле. Электроэлюируют ДНК в иитерва- ле размеров тинозин- о( 1 гена (90- 105 пар оснований).

Плазмиду pBR322 (0,5 мкг) обрабатывают BamHI и EcoRI рестрикцион- ными эндонуклеазами, фрагменты разделяют электрофорезом на полиакриламидном геле. Больший фрагмент вьоде- ляют из геля электроэлюированием и последовательно лигируют с собранной синтетической ДНК. Эту смесь используют для трансформирования Е.со- 11 К12 294. 5% трансформационной сме си помещают на ZB пластины, содержащие 20 мкг/мл ампициллина. Четыре полученные колонии, устойчивые к

30

аммония (объем/объем, 4 мл) и экстра- 25 ампициллину, чувствительны к тетра- гируют этиловым эфиром (3«2 мл). Водную фазу концентрируют до 1-2 мл, часть обрабатьтают с помощью HPZC для очистки 12с Фракции, соответствующие основному пику, собирают (прибл. 2 А554 еД) и концентрируют до 5 мл. Конечный продукт 12 обессоливают на Биогеле Р-2 (1, см), элюируя 20%-ным водным этанолом, сушат досуха и повторно суспендируют в воде (200 мкл) до получения раствора AQSI Ю. Последовательность 12 подтверждена двумерным анализом последовательностей

Полный тимозин-о/ 1 ген собирают из 16 синтетических олигонуклеоти- дов. Микрограммные количества олиго- нуклеотидов от Те до количественно фосфорилируют ( ) - ATF в присутствии Т4 полинуклеотидкииазы до получения специфических активностей приблизительно 1 Ки/моль. Радиомечен- ные фрагменты очищают электрофорезом на геле (20%-ный полиакриламид/ 7М мочевина)Т Последовательности в элюированных фрагментах индетифи- цируют двумерным электрофорезом (гомохроматографией). Фрагменты Т и оставляют нефосфорилированными для уменьщения нежелательной полимеризации во время последующих реакций ,лигирования. Эти олигонуклео- тиды (2 мкг каждый) собирают в четыре группы из четырех фрагментов

циклину, что предполагает включение гена устойчивости к тетрациклину. Анализ плазмид из этих четырех колоний показал, что в каждом случае . плазмида, выжженная pTh 1, содержит III сайт, не находящийся в самой pBR322, что указьтает на наличие тимозин-Ct1 гена, и фрагмент (приблизительно 105 пар оснований), полу2J ченный расщеплением BamHI/EcoRI. Плазмида pThcA I содержит ген, определяющий устойчивость к ампициллину, и структуральный геи, определяющий тимозин-о 1, клонированный

40 по его 5 кодирующей конец нити в EcoRI сайт и по его З концу в BamHI сайт Ген тимозина содержит также Bglll сайт. Для создания плазмиды, способной прииять ZE /d/ фрагмент,

д5 подготовленный ранее, pThedl был выжжен EcoRI с последующей реакцией полимеразы Кленова 1 с dTTP и dATP к тупым EcoRI остаткам. EgIII выжигание полученного продукта создает линейный ДНК фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину, и иа его противоположных концах - липкий Bgllll остаток и тупой конец. Полученный продукт может быть рецир- куляризоваы путем реакции с ZE /d/ фрагментом, содержащим Bdllll липкий конец и тупой конец, в присутствии Т4 лигазы до получения плазмиды рТгр24. При этом EcoRI сайт воссоз50

55

24

Т4 ДНК лигазой. Продукт реакции очищают гель-электрофорезом на 15%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7М мочевины. Четыре вьщеленных продукта лигируют вместе, реакционную смесь разделяют с помощью электрофореза на 10%-ном полиакриламидном геле. Электроэлюируют ДНК в иитерва- ле размеров тинозин- о( 1 гена (90- 105 пар оснований).

Плазмиду pBR322 (0,5 мкг) обрабатывают BamHI и EcoRI рестрикцион- ными эндонуклеазами, фрагменты разделяют электрофорезом на полиакриламидном геле. Больший фрагмент вьоде- ляют из геля электроэлюированием и последовательно лигируют с собранной синтетической ДНК. Эту смесь используют для трансформирования Е.со- 11 К12 294. 5% трансформационной смеси помещают на ZB пластины, содержащие 20 мкг/мл ампициллина. Четыре полученные колонии, устойчивые к

ампициллину, чувствительны к тетра-

циклину, что предполагает включение гена устойчивости к тетрациклину. Анализ плазмид из этих четырех колоний показал, что в каждом случае . плазмида, выжженная pTh 1, содержит III сайт, не находящийся в самой pBR322, что указьтает на наличие тимозин-Ct1 гена, и фрагмент (приблизительно 105 пар оснований), полученный расщеплением BamHI/EcoRI. Плазмида pThcA I содержит ген, определяющий устойчивость к ампициллину, и структуральный геи, определяющий тимозин-о 1, клонированный

по его 5 кодирующей конец нити в EcoRI сайт и по его З концу в BamHI сайт Ген тимозина содержит также Bglll сайт. Для создания плазмиды, способной прииять ZE /d/ фрагмент,

подготовленный ранее, pThedl был выжжен EcoRI с последующей реакцией полимеразы Кленова 1 с dTTP и dATP к тупым EcoRI остаткам. EgIII выжигание полученного продукта создает линейный ДНК фрагмент, содержащий ген устойчивости к ампициллину, и иа его противоположных концах - липкий Bgllll остаток и тупой конец. Полученный продукт может быть рецир- куляризоваы путем реакции с ZE /d/ фрагментом, содержащим Bdllll липкий конец и тупой конец, в присутствии Т4 лигазы до получения плазмиды рТгр24. При этом EcoRI сайт воссоз

дают в положении, где проходит ли- гирование тупого конца.

Последовательное вьорсигание pTrpZABglll и EcoRI с последующим PAGE и электроэлюированием приводит к получению фрагмента, содержащего кодоны для ZE /d/ полипептида с Bgllll липким концом и EcoRI липким концом, прилегающим к ГО 3 кодирующему терминусуо ZE /d/ фрагмент клонируют в Bgllll сайт плазмиды р50М7Д2 до получения ZE прлипеп- тид/самотостатин сшивочного протеина, экспрессированного под контро- лем триптофан промотор/оператора.

16 мкг плазмиды pSOM7u2 разбавляют в 200,мкл буфера, содержащего 20 мМ Tris (рН 7,5), 5 мМ MgCl, 0,02% РАО детергента и 100 мМ NaCl, и обрабатьшают 0,5 ед. EcnRI. Спустя 15 мин при реакционную смесь экстрагируют фенолом, хлороформом, осаждают этанолом и последовательно выжигают Bgllll, Больший из полученных фрагментов выделяют с помощью PAGE, а затем электроэлюированием. Этот фрагмент содержит кодоны ZE /P/ для проксимального конца ZE полипептида, то есть того, который расположен раньще BgLIII сайта. Этот фрагмент лигируют затем с вышеуказанными ZE /d/ фрагментами в присутствии. Т4 ДНК лигазы до получения плазмиды Р50М7л2/14, которая после трансформации в E.coli К12 294 эффективно продуцирует сшивочиый протеин, состоящий из полностью реконструированного ZE полипептида и самотостатина под контролем триптофан промотор/оператора.

Плазмиду pBR322 выжигают Hinglll выступающие Hindlll концы выжигают SI нуклеазой. Выжигание SI нукле- азой включает обработку 10 мкг Hindlll расщепленной pBR322 в 30 мкл SI буфера (0,3 М NaCl, 1 мМ ZnCLj , 25 мМ ацетата натрия; рН 4,5), с 300 ед. SI нуклеазы в течение 30 мин при . Реакцию останавливают, добавляя 1 мкл 30vl нуклеазного стоп- раствора (0,8 М трис-основания, 50 ь ЕДТА). Полученную смесь экстрагируют фенолом, хлороформом, осаждают этанолом, а затем выжигают EcoRI, как описано ранее Фрагмент, полученный с помощью PAGE с последующим электроэлюированием, имеет EcoRI липкий и тупой концы, кодирующая

0

0

5

0

5

5

0

5

0

5

нить последнег о начинается с нукле- отида тимидина. Выжженный Hindlll SI остаток, начинаппийся с тимидина, можно присоединить к Bgllll остатку, обработанному полимеразой, поэтому плазмиду р50М7Д2, полученную в примере 5, выжигают Bgllll, полученные Bgllll липкие дважды обрабатывают полимеразой Кленова 1, используя все 4 деоксинуклеотидтри- фосфаты, EcoRI расщепление полученного продукта с последующей обработкой PAGE и электроэлюированием маленького фрагмента дает линейный участок ДНК, содержащий триптофан промотор/оператор и кодоны ZE проксимальной последовательности, расположенной раньше Bglll сайта (ZE /P/ ). Полученный продукт имеет EcoRI конец и тупой конец, полученный при заполнении Bglll сайта. Однако Bglll сайт реконструируют, лигируя тупой конец с тупым концом указанного вьше выжженного Hindlll SI фрагмента. Таким образом, два фрагмента лигируют в присутствии Т4 ДНК лигазы до образования рецир- куляризованной плазмиды рИКУ 10,которая распространяется трансформацией в компетентные E.coli К12 294 клетки. Устойчивые к тетрациклину клетки, содержащие рекомбинантную плазмид- ную рнКУЮ, отбирают, а плазмидную ДНК экстрагируют. После выжигания Bglll и PStI с последующим выделением PAGE и электроэлюированием крупного фрагмента получают целевой линейный кусок ДНК с PStI и Bglll липкими концами. Этот ДНК фрагмент, полученный из рНКУЮ, содержит источник репликации и поэтому пригоден к использованию в качестве компоненты при конструировании плазмиды рН17Д4д1, в которой оба гена, кодирующих trpZE (полипептидный сшивоч- ный белок и устойчивый к тетрациклину контролируются trp промотор/ оператором.

Плазмиду.РВОМ7Д2Д4, полученную в примере 5, подвергают частичному дигерированию EcnRI с последующим дигерированием PStI. Полученный фрагмент, содержащий trp промотор/ оператор, вьщеляют с помощью PAGE с последующим электроэлюированнем Частичное выжигание EcoRI необходимо для получения фрагмента, который расщепляется рядом З концом гена

самотостатина, но не был расщеплен по EcoRI сайту, имеющему место между геном устойчивости к ампициллину и trp промотор/оператором.

Устойчивость к ампициллину, потерянную при Pstl отщеплении в гене устойчивости к ампициллину, восстанавливают путем лигирования с конечным рНКУЮ линейным производным ДНК, полученным ранее в примере 5.

В качестве первой стадии при конструировании гена, кодирующего первые 32 аминокислоты проинсулина, получают серию из 18 олигонуклеотидов, представленных в табл. 2

Некоторые нуклеотиды используют для конструирования гена В цепи человеческого инсулина. Два нуклео- тида (В5 и В10) включают Hpall и терминальные BamHl и EcoRI рестрик- ционные сайты. Терминальные сайты полезны для целей клонирования.

8 олигонуклеотидов Н1-Н8, ранее использованных для конструирования левой половины гена В цепи человеческого инсулина, содержат кодирующую последовательность для 1-13 аминокислот гена В цепи и дополнительный N-терминальный метионино Правую половину гена В цепи конструируют из олигонуклеотидов В,, В, В В4. BS, Вб, В7, В, BO и лигиро- ванием, используя Т4 ДНК лигазу. Полученный генный фрагмент кодирует В цепь человеческого инсулина и первый аргинин мостиковой цепи Hpall рест- рикционный сайт включают в генную последовательность в тот же самый считывающий фрагмент,,расположенный так же, как Hpall сайт, в гене инсулина человека. После очистки ли- гированного генного фрагмента электрофорезом на полиакриламидном геле и элюировання самой большой полосы дак фрагмент включают в HindIII- BamHI расщепленную плазмиду pBR322. Полученную плазмиду, обозначенную рВЗ, включают в E.coli К12 294 путем трансформации. Плазмида придает устойчивость к антибиотикам (ампициллину и тетрациклину) и, как обнаружено, соде)жит целевую последовательность нуклеотидов

Два фрагмента 58 пар оснований Hindi11-ВагаН1 фрагмент рВЗ и 46 пар оснований EcoRI-Hindlll фрагмент pBHI лигируют для получения фрагмента, имеющего EcoRI и BamHI концы.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Этот фрагмент лигируют обычным способом в EcoRI и BamHI рестриктирован- ную плазмиду pBR322. Полученную плазмиду, обозначенную р1ВЗ, клонируют затем в E.coli К12 294. После обычной амплификации и выделения плазмиду р1ВЗ выжигают EcoRI и Hpall до получения синтетического генного фрагмента, который кодирует N-терми- нальные проинсулиновые аминокислоты во главе с метионином. Синтетический ген выделяют обычньм способом с помощью электрофореза на полиакриламид- ном геле о

Декануклеотид 18, который содержит как BamHI узнающую последовательность, так и 3 участок политимиди- ловой кислоты, содержащий приблизительно 20 остатков, синтезируют и используют для стимулирования AMV обратной транскриптазы для синтеза кДНК. Праймер получают, используя деоксинуклеотидилтрансферазу с 1 мкм BamHI декануклеотидов в реакционном объеме 0,6 мл, содержащем 1,5« «10 мкмоль ТТРо Реакцию ведут при 37°С в течение часа в буферной системе. Выделяют полиАмРНК (2,5 мкг) ткани инсулиномы человека и превращают в дважды скрученную кДНК (практически аналогичным способом; „ :Sa- тем реакционный объем (80 мкл), содержащий 15 1 Tris НС1 (рН 8,3 при ), 21 мМ КС1, 8 мМ MgClg, 30 мМ меркаптоэтанола, 2 мМ праймера dCCGGATCCGGTT,g и 1 мМ dNTPS, предварительно инкубированного при после добавления AMV обратной транскриптазы, инкубируют в течение 15 мин при . Полученную РНК/ДНК денатурируют в соответствии с обычной ме тодикойо Нить комплементарной кДНК синтезируют в реакционном объеме 150 мкл, содержащем 25 Tris HCl (рН 8,3), 33 КС1, 4 мМ MgCL, 15 1 Ь-меркаптозтанола, 1 мМ dNTPS и 9 ед. полимеразы Кленова I. Полученную смесь инкубируют при 15 С в течение 90 мин, а затем 15 часов - при . Осуществляют нуклеазное выжигание .- в течение 2 ч при 37 °С, используя 1000 ед. S/нуклеазы/.Двуни- тевую кДИК (0,37 мгк) обрабатывают электрофорезом на 8%-ном полиакрил- амидном геле. ДНК фрагменты, крупнее чем 500 пар оснований, элюируют. К 3 концам фрагментов добавляют остатки олигодеоксицитидиловой кислоты, используя терминальную деокси- нуклеотидилтрансферазу, кЛНК с dC концами отжигают до pPjR322, затем выжигают Pstl рестрикционным ферментом и сшивают с деоксигуанидиловой кислотой, используя терминальную деоксинуклеотидилтрансферазу. Полученные плазмиды используют для трансформации E.coli К 12 294. Полученные клетки помещают на ZB и ТЕТ среду. Колонии, устойчивые к тетрациклину, но чувствительные к ампициллину, выделяют и скринируют по плазмидам, которые содержат три PstI рестрикци- онных сайта. Одна плазмида, обозначенная рНПОА, содержит вставку из 600 пар оснований, дает ожидаемый PstI рестрикционный тип и содержит BamHI сайт между З полиА и полиСС, введенными при получении кДНК.

Сегмент синтетического гена, кодирующий первые 31 аминокислоты про- инсулина, выделяют из 50 мкг плазмиды р1ВЗ, используя рестрикционную эндонуклеазу EcoRI и Hpall, как описано ранее. Первый фрагмент также содержит АТС последовательность для метионина вместо предпоследователь- ности проинсулина

Сегмент гена кДНК, кодируюи й аминокислоты 32-86, так же, как трансляционный стоп-сигнал и 3 нетранслируемый участок мРНК, выделяют из 40 мкг плазмиды рН1104, которую обрабатьшают вначале BamHI, а затем Hpall рестрикционными ферментами. Эти фрагменты вьщеляют электрофорезом на полиакриламидном геле с последующим электроэлюированием. Генные фрагменты соединяют, обрабатывая Т4 ДНК лигазой в 20 мкл лигаз- ного буфера при 4 С в течение 24 ч. Полученную смесь разбавляют 50 мкл , обычным способом экстрагируют фенолом и хлороформом, а затем осаждают этанолом.

Полученную ДНК обрабатывают BamHI и EcoRI рестрикционными ферментами для регенерации этих и удаления генных полимеров. Собранный проинсулированный ген выделяют электрофорезом на полиакриламидном геле и лигируют (используя Т4 ДНК лигазы) для EcoRI и BamHI дигерирования плаз МИД pBR322. Полученную ДНК используют для трансформации E.coli К12 294, а затем полученные колонии скринируют по устойчивости к тетрациклину и

0

5

0

0

ампициллину. Плаэмида рН13, выделенная из одной из таких колоний, содержит целевой ген проинсулина, который затем характеризуют с помощью анализа нуклеотидньгх последовательностей.

Полный ген проинсулина человека, включающий N-терминальный кодон, который кодирует метионин, выделяют из плазмиды рН13 обработкой EcoRI и BamHI рестрикционными ферментами. Целевой фрагмент очищают с помощью гель-электрофореза, а затем лигируют (используя Т4 ДНК лигазу) с частичным диджестом плазмиды pSOM7u2&4 Pstl-EcoRI (получена н примере 5) и большим из Pstl-Bglll фрагментов плазмиды рНКУЮ (полученной в примере 5). Затем мкг полного гена проинсулина человека с EcoRI и BamHI концами, 4 мкг Pstl-EcoRI (частичный) pSOM7A2u4 фрагмента и около 1 мкг Pstl-Bglll фрагмента рНКУЮ лигируют при 4 С в течение 5 24 ч, используя Т4 ДНК лигазу в ли- гирующем буфере. Лигированную ДНК смесь используют для трансформирования E.coli К12 294. Колонии, которые растут как на ампициллине, так и на тетрациклине, отбирают. Обнаружено, что они содержат целевую плазмиду pHI7u4JSl и экспрессируют протеин молекулярного веса, ожидаемого от слияния trpZE-проинсулина, Плазмиду рН1 А1 , которая экспрес- сирует вьшеуказанный протеин, полностью характеризуют как по ДНК последовательности, так и по рестрикционным сайтам обоих включенных генов, а также по вектору.

Пример 6. Около 5 мкг ДНК плазмиды рН 17Д4Д1, 10 мкл (10 X) реакционного буфера, 80 мкл воды и 5 мкл (5 ед.) Hpal рестрикционного фермента инкубируют при 37 С в течение J ч. Затем реакцию гасят, инкубируя при 70°С э течение 5 мин. Смесь охлаждают на льду, добавляют около 12 мкл Ш Tris НС1 (рН ), 7 мкл воды и 1 мкл (10 ед.) ERoRI рестрикционного фермента. Полученную смесь инкубируют вначале при 37 С в течение часа, а затем при в течение 5 мин После охлаждения льдом полученную ДНК экстрагируют фенолом и смесью хлороформ: изоами- ловый спирт (24:1), а затем осаждают этанолом. Целевой - 253Ьр EcoRI- Hpal фрагмент обычным способом вы5

0

5

0

5

деляют электрофорезом на полиакрил- амидном геле с электроэлюнрованием н осаждают ЕТОН, затем растворяют в мкл ТЕ буфера н хранят при до дальнейшего использования.

- 20 мкг ДНК плазмиды pH17йA l в 32 мкл (51) EcoRI реакционного буфера, 198 мкл воды и А мкл EcpRI рест- рикционного фермента (20 едо) инкубируют в течение приблизительно часа. Затем реакцию заканчивают инкубированием при в течение 5 мин Полученный 862Ьр EcoRI фрагмент выделяют электрофорезом на 6%-ном по- лиакриламидном геле с последующим электроэлюированием и осаждением этанолом. Затем фрагмент растворяют в МОО мкл Hpal буфера, содержащего 16 ед. Hpal рестрикционного фермента. После 1,5 ч инкубирования при добавляют 7,5 ед TagI рестрикционного фермента, инкубируют в течение еще одного часа, полученные фрагменты вьщеляют обычным способом на 7,5%-ном полиакриламидном геле. Целевой ЗАЬр Hpal-Tagl фрагмент выделяют электроэлюированием и осаждением этанолом, а затем растворяют в 5 мкл ТЕ буфера.

5 мкг ДНК плазмиды pBR322, 10 мк ClaC реакционной смеси, 77,5 мкл воды и 7,5 мкл (15 ед.) Clal рестрикционного фермента инкубируют при в течение ч. Затем реакцию заканчивают, инкубируя смесь лри в течение 5 мин. Смесь охлаждают на льду и добавляют около 12,5 мкл Ш Tris НС1 (рН .7,2), 6,25 мкл Ш NaCl, 2,5 мкл О,1М MgCl и 1 мкл (10 ед.) EcoRI рестрикцнон- ного фермента. Полученную смесь ин5 ССАСА АТ& ТТС ССА ТТ& GAG GAT CAT ТАА АТ& ТТС CCA ССС АТС

.rrr rrr rrr rri lit ri lit fif llf III rrr rri ril III

3 TCT TAC AAC C&T AAC СТА СТА СТА ATT TAG AA& BCT C&G TAG

Tcc TTo Tcc- ccc era ттт ccc AAC ест стсст

г 11 r f f f «f M r f f r r f I f f f f I f I M I r ACG AAC AG-C CC& CAC AAA CG& ТТБ CGA С

Целевую линкерную последовательность синтезируют модифицированным фосфотриэфирным способом (указанный синтез конкретно иллюстрирован в примере 1).

Около 20 пмоль линкера ДНК примера 7; 1 мкг pNC608 диджеста, примера 7; 0,5 мкл плазмкдного pCZlOl -Ю.ЗиЬ RamHI-EcoRI фрагмента (покубируют вначале при в течение

1 ч, а затем при в течение

5 мин. После охлаждения на льду полученную ДНК обрабатьшают электрофорезом на 1%-ном агарозном геле. Крупный фрагмент выделяют элюирова- нием и осаждают этанолом, затем растворяют в /-20 мкл ТЕ буфера и хранят при до дальнейшего использования.

Около 0,2 MKr v-253bp EcoRI-Hpal фрагмента и 0,5 мкг Hpal-TagI фрагмента примера 6 и 0,1 мкг EcoRIGlal диджеста примера 6 лигируют и используют для трансформации E.coli К12 RV308.

Часть полученных трансформантов, как показано с помощью электрофореза

на агарозном геле и других тестов, содержит только целевую ,6kb плаз- мидуо Такой трансформант, обозначенный E.coli K12PV308/PNM608, отбирают, помещают на TV агар, содержащий

соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методики, Плазмида рММбОВ является предпочтительным источником - 287Ьр EcoRI-Clal/TagI/

фрагмента плазмиды pH7J .

Пример 7 о Около 5 мкг ДНК плазмиды pNM608 в 50 мкл Medium Salt буфера инкубируют с 10 ед. каждого из рестрикционных ферментов EcoRI и Clal при 37°С в течение 1 ч. После добавления 5 мкл 3 М ацетата натрия (рН 7,0) ДНК осаждают 3 объемами 100%-ного этанола Целевой ДНК дид- жест растворяют в 100 мкл ТЕ буфера и хранят при 0°С до дальнейшего

использования

I

3

лученного в соответствии с методикой примера 2, за исключением того, что используют EcoRI и соответствующий буфер вместо Xbal рестрикцион- ного фермента и буфера), I мкг плазмиды pCZlOl 0,6kb BaraHI-HgiAI фрагмента примера 2 лигируют, полученную плазмиду используют для трансформации E.coli К12КУ308„

Часть полученных трансформа}{тов, что удобно показать с помощью электрофореза на агарозном геле и других тестов, содержит только целевую .Skb плазмиду. Такой трансформант, обозначенный E.coli К12PV308/pCZ105,1 отбирают на TV агаре, содержагдем соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методики. Полученные клетки, как показано SDS гель-электрофорезом, RIA и другими тестами, экспрессирует met - в GH в больших

5 СБАСА АТ& ТТС ССА ТТ& GAT рдт &АГ ТАА ATG ТТС ССА &СС АТ&

, f м I I f г г г г f f г г f г г г t f г г г f fir г г г г г I Ml м г

3TDT ТАС AAG С&Т ААС СТА СТА СТА АТТ ТАС АА& &&Т С&С ТАС

ТСС TTG ТСС CGC СТ& ТТТ GCC ААС ССТ CTGCT 5

г г г f f I f I I r I f r t f r r r f r I I r r t .

AG6 AAC ACC CCG GAG AAA CGG TTG CGA С5

Указанную выше определенную линкерную последовательность конструируют в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12RV308/pCZ105,2, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для производства и выделения плазмиды pCZ105,2o Эти трансформанты, как показано с помощью SDS электрофореза.

5 CGACC АТС GAT CAG- GAG ТАА АТ& ТТС CCG GCT ATG ТСС TTG

.rrr rrr rrt rrt rtf fir rrr rrr iri rrr tri rii irr

у TGG TAC СТА GTC СТО ATT TAC AAG CGC CGA TAC AGG AAC

TCC GCC CTC TTT CCC AAC GCT CTCCT 3 t I 11 I r r I I r I r I I I r I r I I,1

AGG CGG GAG AAA CGG TTG CGA С5

Конструируют указанную линкерную последовательность. Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12RV308/pCZ106,l, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют обычиын способом для последующего получения и выделения плазмиды ,l. Эти трансформанты, как по- каэаыо с помощью SDS гель-электрофореза, PIA и других тестов, экспрес- сируют met- bGH с высокими уровнями.

количрстнлх . Так КПК плазмипл рС7.1П5, 1 содержит термоиндупирусмый ропликон быстрого роста, максимальная экспрессия net-bGH происходит при температурах культивирования около ,

Пример 8, Пелевые конструкции получают в соответствии со способом по примеру 7 с тем лгапь отличием, что вместо линкерной последовательности примера 7 используют следующую ДНК линкерную последовательность:

RTA и других тестов, экспрессируют net-bGH с высоким уровнем. Так как плазмида pCZ105,2 содержит термоин- дуцируемый репликон быстрого рос та, максимальная экспрессия met- bGH наблюдается при культивировании при температурах около .

Пример 9. Целевое конструирование осуществляют по способу примера 7, но вместо линкерной последовательности примера 7 используют ДНК последовательность

Так как плазмида pCZ106,1 содержит термоиндуцируемый репликон быстрого роста, максимальная экспрессия roet- bGH наблюдается при культив €ровании при теьтературе около .

Пример 10. Целевое конструирование осуществляют практически в соответствии со способом примера 7, но вместо линкерной последовательности примера 7 используют последовательность ДНК

5 СОДСС АТ& GAT CAT AAC TAA AT& TTT CC& CCT ATG TCC TTG

,tif ftr Iff III III III III III III III ifi irr irr

3 TCC TAG СТА СТА ТТС ATT TAG AAA GCC CGA TAG AGC AAG

TCC CCC CTC TTT CCC AAG CCT irr r rI tit IrI r r r ftr r r I АБС CCC &АБ AAA CCC TTC CCA

Конструируют указанную выше лин- керную последовательность в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные здесь E.coli,K12RV 308/pCZn2, помещают на TV агар, содержащий со- ответствующие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для последующего получения и вьщеления пла змиды pCZ112,. Эти трансформан- ты, как показано с помощью SDS гель- электрофореза, RIA и других тестов,

Г

5

CCAGG ATG GAT CAT AAC CAD -IMl f f I r I r III irr fir

J TC& TAC СТА СТА TTC GTG

TCC f f r

ACC

CCC CTC TTT

f I I r r r Ml

CCC CAC AAA

GCG

AAC r r t

C6C TT& CCA

CCT f r f

Конструируют указанную линкерную последовательность в соответствии с обычной методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12RV309/pCZl12,2, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем обычны способом культивируют до получения и выделения плазмиды pCZll.2,2. Эти трансформанты как покдзано по данным гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрессируют met-bGH с вы3

CTACAGGGTATTAATA АТС ДАТ t : f f I I г I f f г f I f f f I r f I TCCCATAATTAT TAC GTA

ATB TCC TTC TCC CCC CTC TTT

«II Ml I If III Ml t f I Iff

TAC ACC AAC ACC CCC GAC AAA

Конструируют указанную вьппе линкерную последовательность в соответствии с обьгчной методикой с

Целевые трансформанты, обозначенные E.coli K12RV308/pCZ1000, помещают на TV агар, содержащий соответствуюпие антибиотики, а затем обычным способом культивируют для получения и выделения плазмиды pCZlOOO.

CTGCT 3 i5

зкспресеируют met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZl12,1 содержит термоиндуцируемый репликон быстрого роста, максимальная экспрессия met-bGH наблюдается при культивировании при температурах около 27°С.

Пример 11, Целевое кон(тру- ирование осуществляют в соответствии со способом примера 7, но вместо лин- керной последовательности примера 7 используют ДНК последовательность

TAA АТС TTT CCC CDT АТС TGC

Iff Itl ffi rrr f f frr fff

ACC TAG AAA CCC CCA TAG ACC

CTCCT I

С

J

5

сокими уровнями. Так как плазмида pCZ112,2 содержит термоиндуцируемый репликон быстрого роста, максимальная экспрессия met-bGH происходит при температуре культивирования около .

Пример 12о Целевое конструирование осуществляют в соответствии с методикой примера 3, заменяя линкерную последовательность примера 2 на ДНК линкерную последовательность

CAC GAC. GAT TAA АТС TTT CCT GCT

Iff If I I f fff Iff TIL I M

GTC iCTC; СТА ATT TAC AAA GGA СЩ

AAC I r r TTC

CCT 111

CCA

CTOCT t

с

3 5

5

Эти трансформанты, как показано по данным гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрессируют raet- bGH с высокими уровнями Так как плазмида pCZlOOO содержит термоиндуцируемый репликон быстрого роста, максимальная экспрессия происходит при культивировании при температурах около .

Пример 13, Целевое конструирование осуществляют практически в соответствии со способом примера 3, за исключением того, что вместо лин5 СТА&АСССТАТТААТА АТС CAT САС ТАА АТ& ТТТ ССС ССТ АТС ТСС

, f М f f f 1 I т f t г I г I т г I III lit Iff lit I I f r I r

3 TCCCATAATTAT TAG СТА &TC

ATT TAC AAA C&C

CCA

т I r TAC ACC

TTC TCC CGC CTC TTT CCC AAC CCT ЬТССТ

Iff lir lir |(t fri lit 111 III 1

AAC ACC CC& GAC АДА CCC TTG CCA С

Конструируют указанную зъте лин- керную последовательность в соответ- 15 ствии с обычней методикой.

Целевые трансформанты, обозначенные здесь E.coli KI 2PV308/pr,Zl 000,1, помещают на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем 20 обычным способом культивируют для последующего получения и выделения плазмиды pCZlOOO, Эти трансформаторы, как показали данные гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрес- 25

5 CTACAGGGTATTAATA АТС CAT GAT

, г f I I I I I I I I I f lit r I r III

jTCCCATAATTAT TAC СТА СТА

TCC TTC TCC CCC CTC TTT CCC AAC CCT CTCCT J

, t I f t I I I I I I I I I I I I I I ( I ( f I I f r I.

AG& AAC AGG CCG CAC AAA CCG TTG CCA С 5

Конструируют указанную выше лин- сокими уровнями. Так как плазмида керную последовательность в соответ- pCZ 1000 содержит термоиндуцируемый ствии с обычной методикой,35 репликон быстрого роста, максималь

Целевые трансформанты, обозначен- ная экспрессия происходит при куль- ные здесь E,coli К12RV308/pCZ1060, помещают иа TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, и обычным

40

тивироваиии при температуре около 37 С,

Пример 15, Целевое конструспособом культршируют для получения и вьщеления плазмиды pCZlOfiO. Эти трансформанты, как показано по данным гель-электрофореза, RIA и других тестов, экспрессируют met-bGH с вы5 CTACAGGGTATTAATA АТС &АТ CAT AAG ТАА ATG TTT CCG CCT АТС

,.ffirilllfllt «If MI Ml Ml Ml MI IMIIIflllM

3 TCCCATAATTAT TAC СТА СТА ТТС ATT TAC AAA GGC CCA TAC

TCC TT& TCC GGC CT& TTT CCC

lit Mr Ml III Ml lit I M

AGC AAC ACG CCC CAC AAA CCC

Конструируют указанную вьше линкерную последовательиость по обычной методике. .

Целевые трансформанты, обозначенные здесь E,coli K12RV308/PCZ1120 помещают а TV агар, содержащий соответствукяцие антибиотики, а затем обычным способом культикерной последовательности примера 3 исполъ-э тот ДНК лиикерную последовательность

lit Iff lit I I f r I r

TAC AAA C&C

CCA

т I r TAC ACC

3

сируют met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZlOOO содержит термоиндуцируемый репликон быстрого роста, максимальная экспрессия raet- bGH происходит при культивировании при температуре около ,

Пример lAg Целевое конструирование осуществляют в соответствии со способом примера 3, используя вместо линкерной последовательности примера 3 ДНК линкерную последовательность

ТАА ATG ТТС

I f 1 I f III

ATT TAC AAG

CCA GCC АТС

III I t I Ml

CCT CCC TAC

ная экспрессия происходит при куль-

0

тивироваиии при температуре около 37 С,

Пример 15, Целевое конструирование осуществляют в соответствии со способом примера 3, но вместо линкериой последовательности примера 3 используют ДНК линкериую последовательность

ААС ССТ GTCCT 3

I М I I I I ..I

ТТС ССА С 5

вируют для получения и выделения плазмиды pCZ1120, Эти трансформанты, как показали данные гель-электрофореза, RTA н других тестов, экспрессируют met-bGH с высокими уровнями. Так как плаэми да pCZn20 содержит термоиндуцнруе- мый репликон быстрого роста, мак55

39

симальная экспрессия met-bGH происходит при температурах около .

Пример 16, Около 5 мкг плаэмиды pNM575 (полученной в примере 1) в 50 мкл Medium Salt буфера инкубируют с 10 ед„ каждого (BamHI и FnuDII) из рестрикционных фермен5 CTA&ACG-CTATTAATA АТС ТТС

,. f I г f I I г I 1 f f т I г f t I

3 TCCCATAATTAT TAG AA&

ССА лес АТТ ССС ТТЛ ТСС АСС

rrr rif f l ТГ1 tif llf irr

CCT TC& TAA GCC AAT ACC TCC

I

Конструируют указанную вьппе лин- керную последовательность в соответствии со способом синтеза, конкретн проиллюстрированным в примере 1„

Лигирование и трансформацию осуществляют следую1дим образом.

Около 20 пмоль ДНК линкера примера 16, 1 мкг BamHI-FnuDII диджеста примера 16 и 0,5 ,2kb BamHI- Xbal фрагмента примера 3 лигируют и используют полученную плазмиду для трансформации E.coli K12RV308 в соответствии со способом примера 2„

Часть полученных трансформантов как показано с помощью электрофорез на агарозном геле, содержит только целевую 10,8kb плазмиду. Трансформанты, обозначенные здесь E.coli K12RV308/pCZ2II40, отбирают, помеща ют на TV агар, содержащий соответствующие антибиотики, а затем культивируют, используя обычные микробиологические методикио Полученные клетки, как показали данные SDS гел электрофореза, RIA и других тестов, экспрессируют met-bGH с высокими уровнями. Так как плазмида pCZ1140 содержит термоиндуцируемый репликой

, максимальная эк-

быстрого роста

5 CTAGACGGTATTAATA АТС TTG GAG GAT GATТАЛ АТС ТТС ССА

I I Г I I I I I f ( f I Iff til III r I I IIIIII III I M III

TCCCATAATTAT TAG AAC CTC СТА СТАATT TAG AAG GGT

CCG ATG JGG TTG TCG GGC CTG TTT CCC AACGCT GTGCT З

r tI f f f r r r Iff III fir Iff Iff I I rIrt r I r

CCC TAC ACC AAC ACG GCC CAC AAA CCC TTGCCA С5, ИЛИ

J CTACACGCTATTAATA ATG TTG CCA TTG GATGAT CAT TAA АТС ТТС

I t r f r I I I I I r r III III III III IIIlit r I t III I I I I I I

TGCCATAATTAT TAC AAO CCT AAG СТАСТА СТА ATT TAC AAG

io

TOB при в течение 1 ч. После добавления 5 мкл ЗМ ацетата натрия (рН 7,0) ДНК осаждают 2 объемами 100%-ного этанола и выделяют. Целевой ДНК диджест растворяют в 1UO мкл ТЕ буфера и хранят при до дальнейшего использования

TTG &AG САГ CAT ТАА АТС ТТС

III 111 г t г I t г Ml f г I г f t

AAC СТС СТА СТА ATT ТАС АА&

САС ААС

f г I I I

CIC ТТС

ест АТС СТС СО 3 fit г t I г I I г . ССА TAG CAG &С 5

5

0

0 5 0

З

спрессия met-bGH происходит при культивировании при температурах около .

I

Ф о р мула изобретения

1„ Способ получения рекомбинант- ной плазмидной ДНК, кодирующей синтез бычьего или человеческого гормона роста, путем объединения фрагментов ДНК, кодирующих липопротеино- вый промотор, область инициации транскрипции, стартовый кодон трансляции, гормон роста и стоп-сигнал трансляции, отличающийся тем, что, с целью повышения вывода метионинового гормона роста, объединяют BamHI-Xbal или BamHI-EcoRI фрагменты плазмиды pCZlOl размером около 10,2kb, включающие рекликон, утрачивающий контроль числа копий при , и липопротеиновый промотор E.coli, причем плазмиду pCZlOl получают лигированием Xbal-BamHI фрагмента плазмиды pIM-l A3 разме ром около 10,2kb с Xbal-BamHI фраг- ментом плазмиды pNM789b и синтетическим линкером следующей нуклео йд- ной последовательности:

С BamHl-FnuIl фрагментом плаэмиды pNM575 с кодоном, инициирующим трансляцию, стартовым кодоном, сайтом связывания пептида и рибосомы, стоп- сигналом трансляции и кодонами первых 14 амшюкислотных остатков бычьего гормона роста или первых 15

аминокислотных остатков человечеС - кого гормона роста,

2, Способ по п. 1, отличают и и с я тем, что к рекомби- нантной ДНК дополнительно присоединяют EcoRI-Clal фрагмент плазмиды рЫМбОб размером 0,29kb, вкл)очающий

г З1А913А644

триптофановьй промотор E.coli, при-дующую нуклеотидную последовательчем синтетический линкер имеет еле-ность:

5 ССАСА АТС ТТС ССА TTG GAC CAT GAT ТАА АТС ТТС ССА GCC

I I I I I г III lit lit III III III III III III 111 III

TOT TAG AA& CCT AAC CTC СТА СТА ATT ТАС AAC GCT CG&

AT& TCC TTC TCC CCC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3 III III III III til III III III til 111 I

TAG AG& AAC AGG CCC GAC AAA CGG TTG CCA С 5, ИЛИ

CGACA ATG TTC

111 r I I r I I

TGT TAG AAC

TG TCC TTC TCC

II n r I I I III

AC AGG AAC AGG

CCA I r r

CGT

GCC I I I

TTG GAT III lit

AAC СТА

СТО- TTT 111 III

CAT I I I

СТА

GCC I t I

GAT TAA A

fit III t

СТА ATT T

AAC I I I

GCT I I t

GT

I

CCG GAC AAA CGG TTG CGA С

С GAC С I I I

TGG

TG TCC t r III

ATG I t t

TAC

GCC f I I

GAT f t I

СТА

CTC I I I

CAG t t t

GTC

GAG TAA ATG TTC CCC GCT

Ml III III III III til

CTC ATT TAC AAG GGC CCA

TTT I I I

GCC 1 11

AC AGG CGG GAG AAA CGG

AAC GCT GTGCTЗ

III lit t

TTD CGA С5 ,

5 CCACC ATG CAT CAT AAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG TCC

t t I til III tit «Mill III III III I t I t I I III

TGC TAC СТА СТА TTC ATT TAC AAA GGC CGA TAC AGD

TTG TCC GG-C CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT З lit III III lit «11 t t I tit t t t t

AAC ACC CCG GAC AAA CGb TT& CGA С S , ИЛИ

5 CGACC AT& GAT GAT AAG GAG TAA ATG TTT CCG GCT ATG

til lit III lib III I -I I t I I 1 I I I I I t I t lit III

TGG TAC СТА СТА TTC CTC AGC TAD AAA GGC CGA TAC

TCC TTO TCC GGC CTC TTT GCC AAC GCT GTGCT

Ml r I I til lit Ml f t t t I t t I f III t

AGG AAC лес CCG GAG AAA CCG TTG CGA.С

CAT I I I

СТА

CC I t I

GAT TAA ATG TTC CCA GCC

fit III til lit tit Ml

СТА ATT TAC AAG G&T CGC

AAC I I I

GCT I I t

GTGCT

I

GG TTG CGA С

ATG TTC CCC GCT

III III III til

TAC AAG GGC CCA

J

5,, И/1И

AT& TCC III 111

TAC AGG

ИЛИ

Л 5

Таблица 1