ИММУНОДЕПРЕССАНТ Российский патент 2005 года по МПК A61K31/404 A61P37/06 

Изобретение относится к новым биологически активным веществам из класса арилгетероалканкарбоновых кислот и может быть использовано в медицине и биологии в качестве основы для создания лекарственных препаратов.

Одним из ведущих механизмов развития аутоиммунных нарушений является патологическая активация Т-лимфоцитов, сопровождающаяся увеличением продукции ростовых факторов для В-клеток, повышением синтеза аутоантител, развитием иммунокомплексных нарушений в различных органах и тканях организма.

Целенаправленная ингибиция функциональной активности Т-лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток чрезвычайно важна для современной транспланталогии в целях предупреждения иммунного отторжения пересаженных органов (почек, печени, сердца) и костного мозга.

Одним из применяемых лекарственных препаратов для снижения функциональной активности Т-лимфоцитов с целью терапии аутоиммунных заболеваний и профилактики реакции отторжения трансплантатов является циклоспорин А (Регистр лекарственных средств России. - Выпуск 9. - 2002 г. - Стр.969), который, будучи эффективньм иммуномодулятором, вызывает ряд серьезных побочных эффектов (нефро- и гепатотоксичность, артериальная гипертензия, анемия, задержка жидкости в организме, судорожные припадки и др.), что существенно затрудняет его широкое применение.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами и не вызывающих побочных реакций, предлагается использовать в качестве иммунодепрессанта новое химическое соединение: трис-(2-гидроксиэтил)аммониевую соль 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты.

Данное соединение является производным алканкарбоновых кислот и обладает антиагрегантными свойствами (“Клиническая эффективность и безопасность цефалоспориновых антибиотиков производства ООО “АБОЛмед”, сб. трудов НИИКИ, АГМУ и МКБ, Новосибирск, 2002, стр.179).

Сущность изобретения заключается в том, что были исследованы иммуномодулирующие свойства трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты по способности данного соединения влиять на количество ядросодержащих клеток крови у мышей (миелоактивные свойства), на гиперчувствительность замедленного типа у мышей (Т-клеточный иммунный ответ), на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов у мышей in vitro ( антипролиферативные свойства в отношении Т- и В-лимфоцитов).

В работе использовали здоровых половозрелых животных: мышей-гибридов (CBAxC57BL/6)F1 (CBF1) обоего пола, 8-10-недельного возраста массой тела 18-20 г. Разброс в группах по исходной массе тела не превышал ±10%. Контрольные и опытные животные одного возраста и получены одновременно из одного питомника ("Рассвет", г. Томск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе. Все исследования проводились в одно и то же время суток (утром). Данные обрабатывались по непараметрическому критерию U Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1. Определение миелоактивных свойств.

Опытной группе животных соединение вводили в дозе 1/10LD₅₀ внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл ежедневно в течение 7 дней, через 24 часа после последнего введения определяли количество ядросодержащих клеток в периферической крови. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель (воду). Критерием оценки миелоактивных свойств является изменение в лейкоцитарной формуле ±20%. Результаты выражали в количестве лейкоцитов в 1 мл крови и в процентах к соответствующему контролю.

Таблица 1Влияние трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты на количество ядросодержащих клеток крови у интактных мышей CBF1ГруппаДоза 1/10LD₅₀ (мг/кг)Кол-во ядросодержащих
клеток% к контролюКонтроль 9,87×10⁶/мл Соединение3007,1×10⁶/мл-22%

Как видно из табл.1, соединение, вводимое в терапевтической дозе 300 мг/кг веса в течение нескольких дней, оказывает выраженный миелодепрессивный эффект.

Пример 2. Оценка влияния соединения на клеточный иммунный ответ.

Соединение в дозе 1/10 LD₅₀ и 1/100 LD₅₀ в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). В день последнего введения соединений мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапы (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контрлатеральную лапу вводили растворитель в том же объеме. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель соединений (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ (Crowle, 1975). Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах.

Таблица 2Влияние трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты на гиперчувствительность замедленного типа у интактных мышей CBF1 Доза 1/10 LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ(%)Доза 1/100 LD₅₀ (мг/кг)ГЗТ(%)Контроль 47,5 47,5Соединение30035,0*3037,6** Р<0,05

Как видно из табл. 2, исследуемое соединение, вводимое мышам в течение нескольких дней в дозе 30 и 300 мг/кг, достоверно подавляет реакцию ГЗТ, которая, в основном, протекает при участии Т-лимфоцитов.

Пример 3. Оценка антипролиферативных свойств соединения.

Клетки селезенки мышей культивировали в круглодонных планшетах для иммунологических реакций ("Linbro") при +37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Абсолютное количество клеток, вносимых в лунку, составляло 200000. Клетки стимулировали митогенами - конканавалином А (Con A, Sigma), влияющим на Т-лимфоциты, или митогеном лаконоса (PWM, Sigma), влияющим на В-лимфоциты. Концентрации митогенов подбирались предварительньм титрованием и использовались в оптимальной дозе, что составило для Con A 2 мкг/мл, а для PWM 1 мкг/мл. Соединение в трех дозах вносили в лунки одновременно с митогенами. Пролиферативную активность клеток оценивали по включению Н³-тимидина в ДНК делящихся клеток. Метку вносили за 16 час до конца культивирования по 1 мкКи в каждую лунку планшета. Для этого основной раствор Н³-тимидина сначала растворяли в среде RPMI-1640 до концентрации 100 мкКи/мл, а затем по 10 мкл раствора добавляли в каждую лунку планшета. По окончании инкубации клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры ("Flow Lab") с помощью аппарата Harvester ("Titertek"). Фильтры высушивали и помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в толуольном сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола, 0,1 г дифенилоксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике "Delta" (США). Результаты выражали в имп/мин включенного тимидина на 2×10⁵ клеток, представлены средние данные по триплету.

Таблица 3Влияние трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты на спонтанную и митоген-стимулированную пролиферацию клеток селезенки интактных мышей in vitro (имп/мин)Доза соединения (мкг/мл)Спонтанная пролиферацияConA-индуцированная пролиферация (2 мкг/мл)PWM-индуцированная пролиферация (1 мкг/мл)Контроль323616010730633040153496559302964166816268*3001068*5912*1349** достоверно соответствующего контроля, Р<0,05

Как видно из данных табл. 3, соединение в дозе 300 мг/мл достоверно подавляет спонтанную и митогениндуцированную пролиферацию клеток селезенки (Т- и В-лимфоциты). В дозе 30 мг/мл соединение также достоверно подавляет пролиферацию клеток селезенки, стимулированную митогеном лаконоса (PWM митоген).

Оценивая в целом результаты можно отметить, что избирательное депрессивное воздействие исследуемого соединения на иммунные реакции организма (миелоактивность, Т-клеточный иммунный ответ, спонтанная и митогенстимулированная пролиферация Т- и В-лимфоцитов клеток селезенки in vitro) позволяет констатировать наличие у трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты иммуномодулирующих свойств супрессорного характера, что дает возможность создания на ее основе препаратов для лечения различных аутоиммунных состояний, а также для профилактики развития иммунных реакций, направленных на отторжение трансплантированных органов и тканей.

Предложено: применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты, ранее известной как гиполипидемическое средство, в качестве иммунодепрессанта. Изобретение позволяет создать препараты, направленные на профилактику отторжения трансплантированных органов и тканей или создавать на ее основе лекарственные средства для лечения различных иммунопатологических состояний. 3 табл.

Применение трис-(2-гидроксиэтил)аммониевой соли 1-метилиндолил-3-тиоуксусной кислоты в качестве иммунодепрессанта.