Способ определения активности амилолитических ферментов Советский патент 1991 года по МПК C12N9/34 

Изобретение относится к спиртовой, дрожжевой и микробиологической промышленности, а именно к способам определения активности ферментных препаратов .

Целью изобретения является ускорение определения с -глюкозидазы дрожжей и повышение точности определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят первую стадию анализа. В пробирку вносят 15 см3 исследуемого раствора дрожжей, приливают последовательно по 1 см3 раствора соля-i ной кислоты концентрацией 5, 0 моль/дм3 ,

раствора сульфата цинка с массовой долей 15% и железистосинеродистого калия с массовой долей 30%. Осуществ-« ляют осаждение белков и коллоидов. Затем в пробирку вносят 15 см3 раствора мальтозы с массовой долей 1П%. Перемешивают содержимое пробирки и фильтруют. Определяют угол поворота плоскости поляризации на автоматическом поляриметре, автоматическом сахариметре или сахариметре с нормальной сахарной шкалой.

По углу поворота плоскости поляризации определяют концентрацию мальтозы.

О СП

4Ь СО СО 0

Параллельно осуществляют вторую стадию. В другую пробирку вносят 15 см3 раствора мальтозы с массовой долей 10%, помещают пробирку в ультратермостат с температурой 40+0,1 С и выдерживают при этой температуре 5-10 мин. Затем приливают 25 см3 исследуемого раствора дрожжей, быстро перемешивают и инкубируют субстрат с ферментом в течение 60 мин в ультратермостате с температурой 4010,1°С.

Дрожжи при этом выполняют двойную функцию - гидролизуют мальтозу до глюкозы и сбраживают образовавшуюся глюкозу до остаточного содержания мальтозы.

Через 60 мин действия фермента на субстрат реакцию инактивируют введением 1 см3 раствора соляной кислоты кон центрацией 5,0 моль/дм3. После инак- тивирования фермента осаждают белки и коллоиды добавлением по 1 см3 сульфата цинка и железистосинеродистого калия. Содержимое пробирок перемеши- вают, охлаждают до 20°С и фильтруют. Определяют угол поворота плоскости поляризации.

Изменение величины угла поворота плоскости поляризации на стадии опре- деления начальной концентрации мальтозы и после ферментативного гидролиза - оставшейся концентрации мальтозы пропорционально количеству о -глюкози- дазы и времени ее действия на маль- тозу.

Расчет производят по формуле

мс.

0АОД391ДПЧ06133 70Г6-ЛП .

Ь(} т,1. я ед/г

МСП - мальтазная (Ј-глюкозидазная) активность, определенная поляриметрическим методом на мальтозе и выраженная в 45 единицах на 1 г дрожжей;

39 - коэффициент, определяющий

количество мальтозы, прогид- ролизованной для глюкозы и сброженной дрожжами, равное CQ разности между начальной концентрацией мальтозы и после ферментативного гидролиза, г; - изменение угла поворота

плоскости поляризации, равное разности поляризаций контрольного и опытного растворов, град;

Q

5

Q

0

5

Q

5

10 - коэффициент перевода граммов в микрограммы; 33 - объем раствора, который подвергается поляриметрирова нию, см3; 60 - продолжительность действия

фермента, мин;

342 - молекулярная масса мальтозы, г (для перевода мкг в ммоль);

а - количество исследуемых дрожжей в инкубационной смеси, г. Полученные по этой формуле результаты выражены в собственных единицах поляриметрического метода. За единицу активности мальтозы (сЈ-глюкозида- зы) принимается такое количество фермента, которое за 1 мин при определенных условиях (рН и температуры) катализирует гидролиз 1 ммоля мальтозы.

Пример. На анализ берут хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevi- siae-821. Из них готовят рабочий раствор. 10 г исследуемых дрожжей вносят в колбу вместимостью 300 см3 и прибавляют 150 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают, на первую и вторую стадии анализа берут по 15 см3 исследуемого рабочего раствора дрож-. жей.

Первую стадию анализа осуществляют сразу после приготовления рабочего раствора в течение 10 мин. К 15 смэ исследуемого раствора дрожжей приливают 1 см3 соляной кислоты концентрацией 5,0 моль/дм3, по 1 см3 сульфата цинка и железистосннеродистого калия с массовой долей 15 и 30% соответственно и 15 см3 раствора мальтозы с массовой долей 10%.

Определяют угол поворота плоскости поляризации раствора после первой стадии Пк, который соответствует начальной концентрации мальтозы в растворе 31,10°.

Вторую стадию осуществляют в течение 60 4мин. К 15 см3 раствора мальтозы с массовой долей 10% приливают 15 см3 исследуемого раствора дрожжей, перемешивают и инкубируют субстрат с ферментом в течение 60 мин, затем инактивируют фермент добавлением 1 см5 соляной кислоты концентрацией 5,0 моль/дм3 и осаждают белки и кол- лоиды добавлением по 1 см3 сульфата цинка и желеэистосинеродистого калия с массовой долей 15 и 30% соответственно. Раствор фильтруют, охлаждают до 20 С и измеряют угол поворота плоскости поляризации раствора на второй стадии Пв, который соответствует концентрации непрогидролиэиро- ванной мальтозы 23,24е.

В инкубационной смеси находятся дрожжи в количестве, г:

п

10-15

t -- - - - в

150

1,0.

Активность оС-глюкозидазы рассчитывают по формуле

I

MCfl,.,86 554§9 ед/гш

Разность в значениях угла поворота плоскости поляризации ДП на первой и второй стадиях

йП Пк-П0

7,861

соответствует концентрации прогидро- лизированной мальтозы.

Изобретение позволяет сократить время анализа в 2 раза (с 2 до 1 ч) и повысить точность определения ei-глю- козидаэы.

10

-

543366

Формула изобретения

Способ определения активности амилолитических ферментов путем проведения анализа с использованием субстрата мальтозы в две стадии, на одной из которых поляриметрированием определяют начальную концентрацию мальтозы в исследуемой пробе дрожжей, а на другой осуществляют ферментативный гидролиз мальтозы, инактивиро- вание ее соляной кислотой и поляриметрическое определение углеводов и расчет величины активности ферментов, отличающийся тем, что, с целью ускорения определения о -глю- козидазы дрожжей и повышения точности определения, из исследуемого субстрата на обеих стадиях перед поля20 риметрированием осаждают белковые и коллоидные вещества смесью сульфата цинка и железистосинеродистого калия и дрожжи вводят в субстрат при концентрации мальтозы, равной 10%, для

25 проведения на второй стадии одновременно с ферментативным гидролизом мальтозы сбраживания образующейся глюкозы.

15

Изобретение относится к спиртовой, дрожжевой и микробиологической промышленности и направлено на ускорение определения оЈ-глкжозидаэы дрожжей и повышение точности ее опредеде- ния. Определение активности с -глюкозидазы осуществляют в две стадии. На первой стадии в пробирку вводят исследуемый раствор дрожжей, концентрированную соляную кислоту, раствор сульфата цинка и железосинероднстого калия и раствор мальтозы. Содержимое фильтруют и определяют угол поворота плоскости поляризации. Параллельно на второй стадии в другую пробирку вносят раствор мальтозы и исследуемый раствор дрожжей. После инкубафш в термостате, реакцию гидролиза инак- тивируют соляной кислотой и осаждают белки и коллоиды добавлениьм сульфата игнка и железосинеродистого калия и определяют угол поворота плоскости поляризации. Активность глкжозидазы опредапяют по разности поворотов угла поляризации на первой и второй стадия;,. с SS (Л