Способ определения активности глюкоамилазы Советский патент 1982 года по МПК C12N9/34 

(5) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ

Изобретение относится к спиртовой и микробиологической промышленности, а именно к способам определения активности фермента глюкоамилазы. Известны глюкозооксидазные способы определения, активности глюкоамилазы, согласно которым 0, раствор крахмала подвергают ферментативному гидролизу глюкоамилазой при 30 С в течение 10 мин, ферментативную реакцию останавливают кипячением, а глюкозу, образовавшуюся в результате ферментативного гидролиза крахмала, определяют при помощи реактивов глюкозооксилазы и пероксилазы, являющихся ферментами, а также хромогенного вещества, например, ферроцианида калия. Возникающая окраска отражает количество глюкозы,образовавшейся действииглюкоамилазы на крахмал. Ин тенсивность окраски определяют колори метрически TI 1 Недостатками этих способ.ов являют ся трудоемкость и длительность выпол нения анализа, а также труднодоступность, сложность и высокая стоимость реактивов, Кроме того, присутствие других амилолитических ферментов в исследуемом объекте в значительных количествах приводит к получению завышенных результатовНаиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения активности амилолитических ферментов, в том числе глюкоамилазы путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования ферментов соляной кислотой, осветления растворов фильтрацией, поляриметрического определения углеводов в две стадии соответственно до и после ферментативного гидролиза и расчета величины активности ферментов по специально разработанным формулам 2. Однако данный способ неспецифичен и предназначен для определения общего суммарнбго действия всех амилолитических ферментов, имеющихся в исследуемом объекте. Недостатком способа является такж неоднозначность получаемых результатов из-за различий в величине удельного вращения углеводов, получаемых при ферментативном гидролизе, а такж необходимость осветления и фильтрова ния растворов перед поляриметрией. Цель изобретения - специфическое определение активности глюкоамилазы в присутствии амилолитических фермен тов, а также ускорение и упрощение способа. Цель достигается тем, что согласно способу определения активности амилолитических ферментов путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования фермента соляной кис лотой, поляриметрического определения углеводов в две стадии, соответственно до и после ферментативного гидролиза и расчета величины активности ферментов, в качестве субстрат для ферментативного гидролиза исполь зуют мальтозу, поляриметрирование ве дут при Я 587-589 нм, а расчет ведут по изменению угла поворота пло кости поляризации на первой и второй стадиях, соответствующему количеству образовавшейся глюкозы или количеству единиц глюкоамилазной активности, определяемой стандартным глюкозоокси дазным методом. Способ осуществляют следующим образом. Проводят первую стадию анализа (контроль). В пробирку вносят 25 МП нагретого до 50°С 2 ;-ного раствора мальтозы в 0,1 М ацетатно-натриевом буфере с рН А,7 (раствор мальтозы должен быть приготовлен не менее, чем за сутки до анализа для установления в нем постоянной величины угла поворота плоскости поляризации). Затем в пробирку вносят 1 мл 5 н соляной кислоты и 5 мл испытуемого раствора глюкоамилазы, нагретого до 50 С После ферментативного гидролиза осуществляют 2-ю стадию. В другую Пробирку вносят 25 мл раствора-мальт зы, приготовленной таким же образом и нагретого до 50°С , а затем 5 мл испытуемого раствора глюкоамилазы, нагретого до 50С, и проводят ферментативный гидролиз мальтозы глюкоамилазой в течение 10-30 мин (преиму щественно 15 мин) в ультратермостате при 50tl),2°C. Затем ферментативную реакцию останавливают добавпением t мл 5 н HGl, После охлаждения растворов до комнатной температуры определяют величину угла поворота плоскости поляризации на поляриметре СУ-3 или на автоматическом поляримет Е-ПЛ или СЛ, имеющих нормальную сахарную шкалу. Определение проводят при длине волны Д - нм, пользуясь трубкой длиной 2 дм. Изменение величины угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиза соответствует образованию из мальтозы глюкозы в качестве единственного продукта действия глюкоамилазы на мальтозу, что позволяет получить совершенно однозначные результаты при определении глюкоамилазы независимо от присутствия других амилолитических ферментов. Изменение величины угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиза пропорционально количество глюкоамилазы и времени ее действия на мальтозу. Поэтому расчет активности глюкоамилазы не требует создания специальных формул, а производится по пропорции между количеством фермента,взятого на анализ, временем его действия и величиной изменения угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиза. Расчет производят следующим образом:P Р - Р, , где Pf - величина угла поворота плоскости поляризации a 1-й стадии (градусы нормальной сахарной шкалы); PQ - величина угла поворота плоскости поляризации на 2-й стадии (градусы нормальной сахарной шкалы); СуР - изменение величины угла поворота плоскости поляризации на 1-й и 2-й стадиях (градусы нормальной сахарной шкалы). где п - количество фермента, взятое на ферментативной гидролиз (мл или г); время ферментативного гидролиза (мин); CkH - изменение величины угла пово рота плоскости поляризации на 1-й и 2-й стадиях, рассчи танное на 1 мин. действия 1 мл или 1 г фермента (граду сы нормальной сахарной шкалы на г или мл в мин). 1 П соответствует образованию 196,8 мкмоль глюкозы из мальтозы. За единицу количества глюкоамилаз принято такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль глюкозы действуя на мальтозу при 50° С в тече ние 1 мин и заданном значении рН. Из этого следует, что 1° дП соответству ет 196,8 ед.поляриметрического метод определения глюкоамилазы на мальтозе (ГлСл/я) . Исходя из-этого соотношения рассчитывают активность глюкоамилазы в 1 г или в 1 см исследуемого объекта При определении активности глюкоамилазы в культуральных жидкостях Aspergillus awamori-466 показано, чт 1 ед. данного поляриметрического метода соответствует 1,92 ед. глюкозооксидазного стандартного метода. Ввиду высокой корреляции результа тов обоих методов активность глюкоамилазы, определенную поляриметричес КИМ методом на мальтозе, можно выражать в результатах глюкозооксидазного метода, являющегося широко распространненным и стандартным методом. Величина пересчетного коэффициента устанавливается для каждого продуцента, так как она является характерным свойством глюкоамилазы каждого продуцента. П р и м е р. На анализ взят фильтрат культуральной жидкости Aspergillu awainori-466. Из него готовят рабочий раствор фермента 10 мл фильтрата куль туральной жидкости вносят в мерную . колбу вместимостью 100 см и объем доводят до метки дистиллированной водой,, Из анализа берут 3 мл рабочего рас вора фермента, которые содержат исходного фильтрата культуральной жидкостиП - 0,3 с„ Величина угла поворота плоскости поляризации, измеренная на автоматимеском поляриметре СЛ и полученная на 1-й стадии Q. ) , равна 11,88, а на 2-й стадии (Р ) - 9,. г.Р 11,88 - 9,54° 2,34 2,34. - - -О о ,J - 0,52 (на 1 см 0,3см .Tsl в 1 мин). ГлСх(;; 19б,8 МКМОЛЬ ГЛЮКОЗЫ 0,52 102,3 ед. поляриметрического метода на мальтозе/см культуральной жидкости. А в единицах глюкозооксидазного метода это будет: ГлC„J, 1,92 X 102,3 196,5 ед„ глюкозооксидазного метода. Предлагаемый способ определения глюкоамилазы специфичен в присутствии других амилолитических ферг(ентов, выполняется в 6-7 раз быстрее глюкозооксидазных способов определения общей осахариваЮ1дей активности ферментов и в 2-3 раза быстрее поляриметрического метода. Простота и высокая скорость осуществления анализа предлагаемым способо м позволяет значительно сократить затраты труда на определение активности глюкоамилазы, это даст экономический эффект в 60 тыс.руб. в год при использовании способа на всех заводах спиртовой промышленности, вырабатывающих и применяющих фермент глюкоамилазу. Формула изобретения Способ определения активности глюкоамилазы путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования ферментов соляной кислотой, поляриметрического определения углеводов а две стадии соответственно до и после ферментативного гидролиза и расчета величины активности ферментов, отличающийся тем, что, с целью повышения томности определения глю-коамилазной активности в присутствии других амилолитических ферментов, а также ускорения и упрощения способа, в качестве субстрата для ферментативного гидролизаиспользуют мальтозу, поляриметрирование проводят при Л 587-589 нм, а расчет ведут по изменению угла поворота плоскости поляризации на первой и второй стадиях, соответствующему количеству образовавшейся глюкозы или количеству единиц глюкоамилазной активности.

7 9200698

определяемой стандартным глюкозе-литической активности. М., 1975,

оксидазным методом. .с,5.

Источники информации,

принятые во внимание при экспертизе2. Авторское свидетельство СССР

ферментные. Петоды определения эмило-1977.