Способ определения осахаривающей способности амилолитических ферментов Советский патент 1978 года по МПК G01N33/14 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСАХАРИВАЮШЕЙ СПОСОБНОСТИ АМИ/ЮЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Известен способ определения осахарн-i ваюшей способиосш амилопитическнх ферментов, предусматривающий ферментативный гидролиз исследуемой пробы, тшктивирование ферментов соляной кислотой, осаждение белков и осветление раствора и определение образовавшихся сахаров с последующим расчетом их количества ij . Недостатком известного способа является то, тго определяют сумму всех углеводов, а расчет осахаривакшей способности производ1гг по какому-либо одному углеводу-глюкозе или мальтозе, преоблг дакядему в растворе в большом количестве. Это приводит к занижению или зашлшеыию значения осахариваюшей способности. Кроме того, известный способ применяют только для анализа ферментов микробного происхождения. Целью изобретения является повышв ние точности и возможности контроля осахаривающей способности амилолитических ферментов различного происхождения. лаг вав мет 40 кот гид рую Сах Эта цель достигается тем, что в предаемом способе определение образошихся Сахаров осуществляют поляририческим методом при длине волны О-45О мм в две стадии, первую из орых проводят перед ферментатшвиы1 г ролизом в исследуемой пробе, а «т - после него, а расчет количества аров ведут по формуле Ос-йП 0,0104)-1000 (100), Л(П ) OCfl - осахариваюшая способиостЦ. К и 0,О104 - коэффициенты, уста(иовленные зкспервгментальио, првчем К 0.0838 и О,О777, П ( п ) количество препарата, взятого на аиализ, мг (мл); 1000(100) - коэффшшвет- перевода из мг в г иа 100 мл жидкого продукта; разиосгь оптического враше нвя растворов, полученных на I и Ц стадиях.

Осаждение белков и осветление раствора гфоводят перед поляриметрическим методом определения образовавшихся Сахаров в растворах сернокислым цинком и ферроцианидом калия.

Сущность способа заключается в еле- пующем.

В пробирку наливают последовательно 10 мл раствора, 1 мл 1н раствора соляной, кислоты, по Д мл осадителей (30%-ный раствор сернокислого цинка и 15%-ный ферроцианнд калия) и 20 мл субстрата. Содержимое пробирки перемешивают и фильтруют. Затем определяют в полученном растворе поляризацию на автоматическом поляриметре в трубке длиной 200 мм прк Л 400-450 нм стадия поляризации, Пк.

Одновременно проводят ферментатив,ный гидролиз исследуемой пробы при температуре 50°С и рН 4,8-4,9 (фосфатный буфер для солодов) тл 4,7 (ацетатный буфер для Грибов), продолжитель}ность реакции ЗО мин, объем реакционной смеси ЗО мл (20 мл субстрата и 10 мл ферментного раствора). Для анали за берут пробирку размером: диаметр 18 мм, длина 180 мм. Наливают в нее 20 мм субстрата и ставят в ультратермосТат (или водяную баню) с постоянной температурой.50°С ±0,2С.

В термостате пробирку выдерживают в течение 5-10 мин для того, чтобы раствор в ней принял температуру, при которой будет проведена ферментативная реакция. Затем наливают в пробирку, находяшуюся в термостате; 10 мл рабочего ферментного раствора, также подогретого до 50 С (солодовой вытяжки, осахаренного сусла, бражки и т. д.), перемешивают и оставляют стоять в термостата ЗОмин.

По истечении этого времени пробирку вынимают из термостата, добавляют 1 мл 1 н раствора , жислоты для инактивирова1шя ферментов. Для осазкдения белков и светлешш раствора гидролизата приливают 1 мл 30%-ного раствора сернокислого цинка, а через некотдрое время остаток сернокислого цинка удаляют прибавлением 1 мл 159&-ного раствора желтой кровяной соли.

В полученном гидролизате определяют поляризацию при той же длине волны jl стадия. Разность : между значениями вращения плоскости поляризации, полученными на I и J стадиях, показывает значение снижения поляризации ( л П)

Осахаривающую способность рассчитывают по формуле, преаставляя в них из меренную величину.

(К-4П--0,0104)-1000(100)

ос,

Л{Л)

где К « 0,083 8,

0,О777 и 0,0104 - коэффициенты установленные экспериментально;

п(п )- количество препарата, солода или жидкого продукта, взятого на анализ, мг (мл)-,

1000(100) - коэффициент перевода из мг в г, и на 10О мл жидкого, продукта;

д П - разность оптического вращения растворов, полученных нд I и И стадиях.

П и м е р 1. На анализ взят зел ный ячменныйсолод. Приготавливают основной раствор - 5 г в 9 О мл-дистиллированной воды и 10 мл буферного раствора. Основной раствор разбавляют в 25 раз. Следоьательно, количество солода И в мг, взятое для анализа, равно 5-4-Ю-1000

иг

Л 100 100

В исследуемой пробе осаждают белки и оставляют раствор сернокислым цинком и 4 рроцианидом калия, а зате.м поляриметрическим методом при длине волны 400 нм определяют образовавшиеся сахара, получая при этом оптическое вращение раствора, равное 8,98 (Пк).

Исследуеьую пробу подвергают ферментативному гидролизу, затем в ней инактивируют Jфepмeнты соляной кислртой. осаждают белки и осветляют раствор аналогичным образом.

После этого проводят вторую стадию определения образовавшихся Сахаров пен Л5фиметрическим методом при тех же параметрах, при этом оптическое врашение раствора составляет - 8,26. (По).

Определяют разность оптического врашенвя.

,98-8,26.о,72Я Подставляем г и д П в формулу

ОСЙ°° °Г°° ° ю. е№

Влажность солода 40%. Осахаривающая активность на абсо-. лютно сухое вещество равна:

Пример 2. На анализ взял сусло, осахаренное глюкобататином ГЧ

Фильтрат сусла разбавляют в 10 раз. lie анализ берут

10- 10

Л

1,Оп/1 1000

Измерение оптического вращения растворов производят на автоматическом поляриметре, получая ;жачения

,4в; ПоМО,а4-, дП-0,64. Подставляем значение в формулу

.i Ю,0838 0,64+0,0104)-100

б,41€а/100мл.

ОС„,,

21

Предлагаемый способ позволяет повысить точность-и возможность контроля осахаривающей способности амилолитичес дих ферментов различного происхождения. Формула изобретения Способ определения осахаривающей способности амилолитических ферментов, предусматривающий ферментативный гидролиз исследуемой пробы, инактивирование ферментов соляной кислотой, осаждение белков и осветление раствора и определение образовавшихся Сахаров с последующим расчетом их .. Чсоличества, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и возможности контроля осахаривающей способности амилолитических ферментов, различного происхожаениЯл .определение образовавшихся Сахаров осуществляют поляриметрическим методом при д;шне волны 400-450 нм в две

стации, первую из которых проводят перед ферментативным гидролизом в исследуемой пробе, а вторую - после него , а расчет количества Сахаров ведут по формуле

(к- йП- 0,0104)4000(100)

ос„

Л(П )

где осакаривающая способность; К и 0,0104 - коэффициенты, установленные экспериментально, причем

К а О,0838 и 0.0777; Yi{n) - количество .препарата, взятого на анализ (мг или мл); lOOO(lOO) - коэффициент перевода из мг в г на 10О мл жидкого продукта; - разность оптяче ского

ДП вращения растворов, полученных на I и 1 стадиях

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

30

1. Бурштейн А. И. Методы исследо вания пищевых продуктов. Киев, 1963 с. 435-439.