Способ получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами Советский патент 1991 года по МПК A61K9/50 A61K9/64 A61K39/02 A61K39/385 

нил)этаноламина в молярном соотношении 9:1, растворенную в 30 мкл этанола, впрыскивают в раствор, содержащий 4 мг бруцеллезного лротективного антигена (соотношение липид:белок 10:1) в 0,4 мл 0,9%-ного раствора NaCI. Полученную ли- пидную дисперсию доводят до 0,5 мл путем добавления 0,9%-ного раствора NaCI и инкубируют при при перемешивании в течение 15 ч. Полученный препарат липо- сом, содержащий бруцеллезный протектив- ный антиген, центрифугируют при 40000д в течение 2,5 ч, и в качестве липосом используют полученный после центрифугирования преципитат.

Пример 2. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но молярное соотношение яичный фосфати- дилхолин:фосфатидил- Ы-(Ы -оксисукци- нимидилсукцинил)этаноламин составляет 4:1.

Пример 3. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве антигена используют чумной кап- сульный антиген Ф-1.

Пример 4. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 2, но в качестве антигена используют чумной кап- сульный антиген Ф-1.

Пример 5. К смеси липидов (77 мг), состоящей из яичного фосфатидилхолина и фосфатидил- М-(М -оксисукцинимйдилсук- цинил)этаноламина в молярном соотношении 9:1, добавляют 2 мл 0,9%-ного раствора NaCI, содержащего 7,7 мг бруцеллезного протектинового антигена (соотношение ли- пид:белок 10:1), полученную суспензию встряхивают и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц и мощности 100-150 Вт в течение 5 мин, полученную липосомную суспензию инкубируютпри 37°С

при перемешивании в течение 5 ч, затем суспензию липосом центрифугируют (40000д; 2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования супернатант.

Пример 6. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, но молярное соотношение яичный фосфати- дилхолин:фосфатидил- М-)М -оксисукци- нимидилсукцинил)этаноламин составляет 4:1.

Пример. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 5, но в качестве антигена используется чумной капсульный антиген Ф-1.

Пример 8. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 6. но в качестве антигена используется чумной капсульный антиген Ф-1.

Пример 9. К смеси липидов (54 мг), состоящей из яичного фосфатидилхолина и фосфатидил-{М-{М -оксисукцинимидилсук- цинил)этаноламина в молярном соотношении 9:1, добавляют 0,3 мл 20%-ного раствора дезоксихолата натрия, полученную смесь инкубируют 30 мин при перемешивании. К полученной дисперсии прибавляют 1,0 мл раствора, содержащего

3,0 мг чумного капсульного антигена Ф-1 (соотношение липид:белок 18:1), полученную смесь инкубируют при 37°С и перемешивании в течение 3 ч, затем суспензию подвергают диализу против дистиллированной воды (3x2 л) в течение 22 ч, затем суспензию лип осом центрифугируют (40000 д; 2,5 ч), и в качестве препарата липосом используют полученный после центрифугирования преципитат.

Пример 10. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 9, но молярное соотношение яичный фосфати- дилхолин:фосфатидил- М-(М -оксисукцини- мидилсукцинил)этаноламин составляет 4:1.

Пример 11. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1, но в качестве липидов используют суммарные фосфолипиды яичного желтка.

Пример 12. Процесс проводят аналогично процессу, описанному в примере 1. но в качестве липидов используют дипальмито- илфосфатидилхолин.

В табл. 1 приведены сравнительные данные предлагаемого и известного способов получения липосом, содержащих бактериальные антигены.

Из табл. 1 видно, что по числу стадий и времени, необходимого для осуществления процесса, предлагаемый способ значительно превосходит известный. Предлагаемый способ имеет промышленную применимость, так как все 4 стадии, его составляющие, технологичны и могут быть достаточно просто оформлены в аппаратурном отношении.

Предлагаемый способ обеспечивает

также высокое качество препарата липосом.

Сравнительная характеристика липосом,коньюгированных белками, полученных

по предлагаемому и известному способам, приведена в табл. 2.

Из данных табл. 2 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение липо- 5 сом,содержащихбелки,

характеризующихся высоким молярным соотношением белок:липид. Высокое молярное соотношение белок:липид обеспечивает оптимальную эпитопную плотность белкового антигена на наружной

поверхности липосом и вследствие этого повышает его иммуногенность, тогда как дальнейшее увеличение эпитопной плотности не приводит к существенным изменениям иммуногенных свойств липосом.

Предлагаемый способ обеспечивает практически полное (75-100%) сохранение антигенных свойств белковых антигенов, тогда как известный способ приводит к снижению функциональной активности белка или к изменению его физико-химических свойств.

Предлагаемый способ получения липосом, конъюгмрованных с бактериальными анти енам обеспечивает максимально воз- можную сохранность антигенных свойств белка, экспонированного на наружной поверхности липосом. Наличие специфичного антигена на наружной поверхности липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, подтверждено титрованием БПА-содержащих липосом в реакции кольп- реципитации с бруцеллезной поливалентной кроличьей сывороткой. При этом титр исходного бруцеллезного протективного антигена составляет 1:64000.

В табл. 3 приведены данные об антигенных свойствах бруцеллезного протективного антигена, конъюгированного с липосомами разными методами.

Как видно из табл. 3, предлагаемый способ обеспечивает относительную антигенную активность, сравнимую с антигенной активностью свободного бруцеллезного протективного антигена, тогда как другие способы в этом отношении малоэффективны.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно упростить процесс получения липосом, конъюгированных с бактериальными антигенами, и повысить их

качество за счет повышенной эпитопной плотности белка на поверхности липосом и сохранения при этом его антигенной активности.

Формула изобретения

1.Способ получения липосом, коньюги- рованных с бактериальными антигенами, предусматривающий модификацию белкового антигена фосфатидил- М- М -оксисук- цинимидилсукцинил)этзноламином, формирование липосом из фосфолипидов, включение антигена в липосомы с последующим инкубированием и выделением целевого продукта центрифугированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения качества целевого продукта за счет увеличения зпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов, модификацию и включение антигенов осуществляют одновременно с формированием липосом путем диспергирования смеси фосфатидил- М-(М -оксисук- цинимидилсукцинил)этаноламина с фосфолипидами в молярном соотношении 4-9:1 в водной-солевом растворе белкового антигена при массовом соотношении антиген :смесь 1:10-18.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что диспергирование осуществляют путем ультразвуковой обработки при 22 кГц и мощности 100-150 Вт.

3.Способ по п. 1,отличающийся тем, что перед диспергированием к смеси добавляют дезоксихолат натрия с последующим удалением детергента диализом.

4.Способ по п. 1,отличающийся тем, что смесь растворяют в этаноле и диспергирование осуществляют путем инжек- ции.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии, касается способов получения липосом, коньюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в иммунологии и медицине для разработки вакцинных и липосомальных диагностических препаратов. Целью изобретения является упрощение способа и повышение качества целевого продукта за счетувеличеИзобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения липосом, коньюгированных с бактериальными антигенами, и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и медицине для повышения иммуногенности бактериальных антигенов, создания вакцинных препаратов с использованием липосом в качестве носителя антигенов, а также для разработки липосомальных диагностических препаратов. ния эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Бактериальные антигены модифицируют фосфати- (М-оксисукцинимидилсукцинил)этано- ламином одновременно с включением их в липосомы и с процессом формирования липосом из фосфолипидов. Для этого в водном растворе бактериальных антигенов диспергируют смесь, состоящую из фосфолипидов и модификатора, взятых в молярном соотношении 4-9:1 при массовом соотношении смеси и антигена 10-18:1, полученную суспензию инкубируют при комнатной температуре и перемешивании, а продукт отделяют центрифугированием. Диспергирование осуществляют либо путем инжек- ции раствора липидов в органическом растворителе, либо путем ультразвуковой обработки смеси, либо солюбилизацией липидов в растворе дезоксихолата натрия с последующим удалением детергента диализом. Способ обеспечивает практически полное (75-100%) сохранение антигенных свойств белковых антигенов. 3 з.п. ф-лы, 3 табл. Целью изобретения является упрощение процесса получения липосом, конъюги- рованных с бактериальными антигенами, и повышение качества препарата за счет увеличения эпитопной плотности белка на поверхности липосом при сохранении антигенных свойств белковых антигенов. Пример 1. Смесь липидов (40 мг), состоящую из, фосфатидилхолина и фосфа- тидил- М-(М -оксисукцинимидилсукцисо с Os СЛ сл СЛ о Сл

Получение системы обращенных мицелл диизооктилсульфо- сукциката в гексан

Солюбчлизация белка в системе обращенных мицелл и инкубация мицеллярного раствора, содержащего белок

Ковалентное связывание белка с фосфатидия- ЈN-(N -оксисукцин- имидилсукцинил)- этаноламином в системе обращенных мицелл

Осаждение Ot-лка ацетоном и фент- рифугчрованпе осадка белка

3-кратндт промыв- Kd белка ацетоном

Удаление остатка ацетона при пониженном давлении

При го т one ние ли- пидной смеси

Получение чипосом методом обращения фаз и включение в липосомы флуоресцентного маркера

Встраивание модифицированного белка в липосомы

Отделение несвязанного с липосо- мами белка центрифугированием в ступенчатом градиенте фиколла-70

Для иммуноглобулина G. Для о -химотрипснна. Для чумного капсульного антигена Ф-1.

Приготовление см«- си липндов

Получение липосом методом нижекции

Проведение реакции коиъюгирования белка с липосомами

Отделение несвя- занного балка от липосом центрифугированием

Показатели

20-50

15,6-516

5,5-8,4 0,18-),г

Сохраня- Уменьшение ется 602 растворн- каталити- мости вел50-100

140-300-v.

Функционал ная активность не

ческой ка в 100 раз изучалась

активно- и более я

стизависимости

от степени его модификации

Характеристики лнпосон приведены для разных количеств фосфатндил-Гм(Н -оксн- сукциннкидилсукцикил) этаколамша (|С-20молД в составе лотосе , что соответствует указанному в формуле изобретения соотношению компонентов. Для бруцеллезного протективкого антигена отношение велок/липнд приведено в мг белка/иг лнпнда из-за гетерогенности антигена по белковому составу.

Способ получения препарата липосок

Свободный бруцеллезный антиген (Б

БПА, пассивно сорбированный ка наружной поверхности фосфатндил- хлолиновых (ФХ) липосои, полученных методом ннжекцни

БПА, включенный в ФХ-липосомы, полученные методом инжекции

БПА, модифицированный пальмитиновой кислотой и включенный в ФХ-липосомы, полученные методом инжекции

БПА, ковалентно связанный с наружной поверхностью ФХ-липосом, содержащих фосфатидил-ГН(Н -охси сукциннмидилсукцнннл)} этаколамин, полученных методом инжакции

БПА, ковалентно связанный с ФХ-липосомами, содержащим )0 мол.Л фосфатиднл-fN-(N -окси- сукцинимидипсукцинилУ этанолами- иа (предлагаемой способ)

Таблиц 2

50-100

65-80т

30-МГ

140-300-v.

2,8-3,9

,«

500

Сохранений на 80Z антигенныхсвойств

ЮОХ-но сокранеяяе антигенных свойств 6«.я- ковых «нтн- гвно

Таблица 3

Относительная антигенная активность