Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной эмбриологии и нейроэндокринологии.

Целью изобретения является обеспечение сохранности тканевой структуры и орга- нотипического развития аденогипофиза.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят жидкую питательную среду по любому известному способу. Подготавливают плоты, предназначенные для удержания эксплантатов на разделе жидкой и газообразной сред во время культивирования. Из гидрофобных материалов наиболее пригодным для изготовления плотов является полиэтилен, обладающий удельной плотностью меньше плотности воды, гидрофобными свойствами и механической прочностью. Плоты из полиэтилена изготавливают в виде дисков толщиной не менее 0,5 мм, диаметром 8,5 мм, в центре диска просверливают

отверстие диаметром 3,5-4мм, противоположные стороны диска обрезают в виде двух параллельных граней, служащих для захватывания и удержания плота пинцетом. Для повышения плавучести плотов их шлифуют на листе из того же материала. Плоты перед использованием стерилизуют 70°-ным этиловым спиртом, промывают в стерильной дистиллированной воде и высушивают под ультрафиолетовой лампой

У куриных зародышей в стерильных условиях выделяют аденофипофиз с прилежащей мезенхимой, изолируя его от промежуточного мозга. Сепарирование тканей проводят под микроскопом в среде для культивирования. Эксплантаты в количестве 1-3 шт. помещают на пористый субстрат - миллипоровый фильтр размером 3x5 мм (тип НА, диаметр пор 0,45 мкм). Фильтры с эксплантатами укладывают на плот, нагруженные плоты переносят пинцетом в

о о

ю о

х.

культуральные чашки на поверхность питательной среды. В одной пластиковой или стеклянной чашке Петри диаметром 35-45 мм, содержащей 3-4 среды, размещают до 7 плотов с эксплантатами. Культивирование тканей проводят при 38° С в атмосфере с 5% С02 в течение 7-13 сут, среду меняют через каждые 2 суток.

Плоты на поверхности жидкой среды группируются в центре чашки Петри, не набухают и не тонут. Культуральная среда поступает к эксплантатам через центральное NЈ -отверстие плота и фильтр. Плоты не дефор- ч мируются при захватывании и переносе их с помощью пинцета, что исключает возможность механического повреждения эксплантатов.

По окончании культивирования плоты отмывают от среды в растворе детергента, шлифуют, промывают дистиллированной водой и хранят в 70°-ном этиловом спирте до повторного использования.

Контроль эффективности способа осуществляют путем гистологического и имму- ногистохимического исследований эксплантатов по окончании культивирования, как показано в следующих примерах.

П р и м е р 1. Культивирование проводят по описанному способу. Аденогипофиз выделяют у зародышей кур белый Леггорн на 7-е сутки инкубации. В качестве питательной среды используют культуральную среду DMEM, содержащую фетальную бычью сыворотку 10%, куриный эмбриональный экстракт 10%, пенициллин 50 ед/мл, стрептомицин 50 мкг/мл. Применяют полиэтиленовые плоты толщиной 0,5 мм. Продолжительность культивирования 9 и 13 сут. Во всех эксплантатах при гистологическом и иммуногистохимическом исследованиях обнаружено органотипическое развитие ткани в виде разрастаний клеточный тяжей и дифференцировка специфических клеток,

содержащих соматотропный гормон (СТГ). В части клеток выявлена экспрессия д -кри- сталлина, характерная для нормального развития аденогипофиза у куриных зародышей.

П р и м е р 2. Культивирование проводят по описанному способу. Зачатки аденогипофиза на стадии кармана Ратке выделяют у зародышей кур белый Леггорн через 4,5 сут

инкубации. Переднюю часть зачатка, включающую презумптивную цефалическую долю аденогипофиза, используют для эксплантации в органной культуре. Применяют жидкую питательную среду, приготовленную на основе культуральной среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и ростстимулирующих реагентов. Для поддерживания эксплантатов на поверхности жидкой среды используют полиэтиленовые плоты толщиной 0,7 мм. Продолжительность культивирования 7 сут. Специальное исследование показывает, что при культивировании аденогипофиза зародыша кур происходит органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировка специфических клеток аленогипофиза, что выявляется различными антисыворотками к пролактину, аденокор- тикотропному гормону, хориальному гонадотропину человека.

Формула изобретения Способ культивирования аденогипофиза куриного зародыша, включающий выделение эксплантатов аденогипофиза и

культивирование их в жидкой питательной среде, отличающийся тем, что, с целью обеспечения сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза, эксплантаты помещают на

0 пористый субстрат, который располагают на плоту, выполненному из полиэтилена толщиной 0,5-0,7 мм, имеющего в центре отверстие.

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к экспериментальной эмбриологии и нейтроэндокринологии. Цель изобретения - обеспечение сохранности тканевой структуры и органотипического развития аденогипофиза. Эксплантаты аденогипофиза располагают на поверхности пористого субстрата, например мембранного фильтра. Последний накладывают на плот, представляющий собой полиэтиленовый диск толщиной 0,5 - 0,7 мм с отверстием в центре. Нагруженный плот помещают в жидкую питательную среду и культивируют в атмосфере с 5% CO₂ в течение 7 - 13 сут со сменой среды через каждые 2-е суток. Способ обеспечивает органотипическое развитие аденогипофизарной ткани и дифференцировку специфических клеток аденогипофиза.