Рекомбинантная плазмидная ДНК 36К-pVH, кодирующая синтез иммуногенного белка 36к вируса осповакцины штамма ЛИВП, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент этого белка Советский патент 1991 года по МПК C12N15/38 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности может быть использовано для получения антисыворотки к иммуногенному белку, а также для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповакцины.

Целью изобретения является создание штамма E.coli - продуцента иммунногенно- го белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИВП.

Сконструирована рекомбинатная плазмида ЗбК-pvH, экспрессирующая химерный белок, состоящий из / -галактозидазы и вирусного белка на ее С-конце. Плазмида 36К- pvH, кодирующая белок 36К вируса осповакцины состоит из следующих элементов:

плазмидная ДНК вектора pUR 290, содержащего ген lac Z с собственным промотором, размер которой 5725 п.н. (мол.м. 3,8 МД);

Hind III - BspR I - фрагмент плазмиды ovH 64 с белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИВП, размер которого 1029 р.н. (мол. м. 0,69 МД);

генетические маркеры - ген устойчивости к амициллину, ген lac Z и ген белка 36К ВОВ. Размер плазмиды ЗбК-pvH равен 6754 п.н. (мол. м.4,5 МД).

Получен штамм Eschericnia coli ВКПМ В 4743 - продуцент иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИПВ.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

о о

ю ел

Морфологические признаки.

Клетки прямые, палочковидной формы с размерами 1,2-1,6x2-6 мкм, подвижные с перитрихиальными жгутиками, грамотрица- тельные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах, оптимальная температура роста 30-37° С, рН 6,8-7,5. При росте на мясопетонном и рыбном агаре развиваются в виде гладких, круглых, блестящих, серых, мутных колоний с ровными краями. При росте в жидких средах вызывают равномерное помутнение с образованием осадка.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в интервале температуре 4-45° С, желатин не разжижают, восстанавливают нитраты и нитриты. В качестве источника углерода используют многие углеводы и аминокислоты, В качестве источ- ника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде пептона и

JMMHOKt CflOT.

Устойчивость к антибиотикам.

Штамм проявляет устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием реком- бинантной плазмиды

Стабильность плазмиды в штамме.

При поддержании штамма в течение 2 лет на рыбном агаре при 4° С или в 30%-ном глицерине при -70° С в присутствии ампициллина не наблюдается перестройки или утери плазмиды.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика под номером ВКПМ В-4743.

П р и м е р 1. Получение штамма бактерий - продуцента белка 36К вируса осповак- цины.

Клетки бактерий E.coli BMH 71-18, содержащие ллазмидную ДНК pvH 290, и клетки бактерий E.coli HB 101, содержащие плазмидную ДНК pvH 64, выращивают в 0,5 л бульона с ампициллином в концентрации 40 мкг/мл до титра 5х108 кл/мл и проводят амплификацию плазмиды в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием (5000д, 5 мин, 4° С) и выделяют из них плаз- мидную ДНК.

Полученные препараты ДНК плазмид pUR 290 и pvH B4 используют для конструирования плазмиды 36К - pvH, которое проводят следующим образом.

Осуществляют неполный гидролиз 120 мкг ДНК pUR 290 эндонуклеазой рестрикции 1 в буфере А (50 мМ трис HCI, рН 7,6 50 мМ NaCI; 10 мМ MgCIa: 1 мМ 2-меркапто- этанол) и электроэлюируют линейную форму плазмиды на диализную мембрану, Выход линейной формы ДНК составляет 10% от суммарного количества гидроли- зованной ДНК. Выступающие липкие концы достраивают до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы. Затем ДНК гид- ролизуют эндонуклеазой рестрикции Hind III в буфере А и электроэлюируют на диализную мембрану фрагмент 5720 п.н.

Для выделения индивидуального гена белка 36К 20 мкг ДНК плазмиды pvH 64, содержащей Hind III-P, фрагмент вируса ос- повакцины инкубируют с эндонуклеазами рестрикции Hind II и Bsp RI в буфере А и электроэлюируют на диализную мембрану фрагмент 1029 п.н.

Полученные препараты ДНК вектора и фрагмента смешивают в соотношении 1:10 в буфере В (66 мМ трис НС, рН 7,5; 6,5 мМ MgCte; 10 мМ дитиотрейтол; 0,4 мМ АТФ) с помощью ДНК-лигазы фагаТ4(72ед/мкл)из расчета 1 мкл Фермента на 50 мкг ДНК. Инкубируют 16-20 ч при 4° С. Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток E.coii BMH 71-18. Трансформированные клетки высевают на агаризовзнчую среду LB с ампициллином (40 мкг/мл) и растят 24 ч при 37° С.

Клоны, содержащие рекомбинатную плазмидную ДНК с геном белка 36К, отбирают с помощью гибридизации in situ с Р- зондом, приготовленным на основе Hind III - Bsp RI фрагмента 1020 п.н. Из клеток клонов, дающих положительный отоо

вет в гибридизации с Р-зондом, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную 36K-pvH, содержащую в своем составе фрагмент вирусной ДНК 1029 п.н. с геном белка 36К.

Анализ совпадения рамок трансляции гена lac Z и гена белка 36К в клонах, содержащих рекомбинатную плазмидную ДНК, осуществляют с помощью доказательства синтеза этими клонами химерного белка с мол. м. 145-150 КД. Для этого клетки из отдельных клонов, дающих положительный

оо

ответ в реакции гибридизации с Р-зондом, высевают в 5 мл LB, содержащего 40 мкг/мл ампициллина, и растят в течение 16ч. Затем 0,35 мл ночной культуры вносят в 0,5 мл свежего LB, содержащего 40 мкг/мл ампициллина, растят до плотности суспензии 0,6-0,7 ОЕ/мл при 600 нм и добавляют изо- пропил-/ -Д-тиогалактолиранозид(ИПТГ)до концентрации 0,001 М для индукции синтеза /2-галактозидазы. Клетки растят еще 4 ч до плотности 1,7 ОЕ/мл при 600 нм. осаждают центрифугированием .(500бд, 5 мин, 4°С ) осадок ресуспендируют в 5 мл физиологического раствора (0,15 М NaCI) и снова осаждают центрифугированием. Для получения лизата клеток осадок ресуспендируют в 0,4 мл 10 мМ трис HCI, рН 8, добавляют 1 мг лизоцима в 0,1 мл 10 мМ трис HCI, рН 8 и выдерживают 20 мин. Затем озвучивают 5 раз по 20 с во льду.

Анализ синтезируемых клетками белков осуществляют с помощью электрофореза в прерывистой буферной системе в 8% ДДС- ПААГ 10 кмл лизата клеток. После окраски белков 0,25% Кумасси в 50%-ном спирте с 7% уксусной кислоты гель отмывают 2-16 ч в 20%-ном спирте с 7% уксусной кислоты.

Результаты проведенного анализа показывают, что отобранные клоны при выращивании на среде с ИПТГ синтезируют белок с мол. м.Иб-ТбО КД. Следовательно, встройку гена белка 35К в векторную плаз- миду pUR 290 осуществляют так, что рамки трансляции генов lac Z и белка ЗбК совпадают, так как согласно первичной структуре Hind II - Р фрагмента при несовпадении рамок трансляции происходит терминация синтеза белка в начале встроенного фрагмента, Таким образом, получают бактериальный продуцент белка 36К вируса осповакцины, обозначенный E.coll ВМН/ЗбК-pvH.

Анализ генетических маркеров в плаз- миде проводят следующим образом.

Резистентно сь к ампициллину клеток штамма E.coli ВМН/ЗбК-pvH, содержащих плазмиду ЗбК-pvH, анализируют на агари- зованной среде с содержанием ампициллина 10-100 мкг/мл. Данные клетки растут на средах с этой концентрацией ампициллина.

Наличие в клетках, содержащих плазмиду ЗбК-pvH, химерного белка устанавливают по окрашиванию колоний E.coli, содержащих эту плазмиду, в синий цвет на агаризованной среде с 0,05 мг/мл 5-бромо- 4-хлоро-З-индоксил-/ -Д-галактопиранози- да(Хда)и 10 3МИПТГ.

Наличие в клетках E.coli, содержащих плазмиду ЗбК-pvH, белка 36К вируса осповакцины, который входит в состав химерного белка, устанавливают по связыванию вирусоспецифической лапинной антисыворотки (ЛА), полученной в результате развития у кролика инфекционного процесса, а также антисыворотки, полученной к мембранам клеток CV-1, инфицированных вирусом осповакцины (анти М), с лизатами клеток E.coli из отдельных клонов в реакции радиоиммуноанализа.

В качестве контроля используют сыворотку неимунного животного (ИКС). В качестве отрицательного контроля антигена используют лизат Е coll, содержащий вместо химерного белка/ - галактозидазу(/ - гал). - в качестве положительного контроля - тот же лизат с добавлением NP-40 фракции вируса осповакцины ( + NP). 5Результаты представлены в виде счетов

радиоактивности (имп/мин). Приведены средние значения результатов двух повторов. Разведения антисывороток 1:50.

Результаты анализа, представленные в 10 таблице, свидетельствуют о том, что экс- прессирующийся химерный белок обладает вирусной антигенной специфичностью, Ла- пинная антисыворотка, полученная в результате развития у кролика инфекционного 5 процесса, содержит антитела, связывающиеся с химерным белком. Исследуемый белок, по-видимому, входит в состав мембран инфицированных клеток, так как связывается с антителами, содержащимися в сыворот- 0 ке к мембранам клеток, инфицированных вирусом.

П р и м е р 2. Иммуногенные свойства белка 36К в составе химерного белка.

Получают моноспецифические антисы- 5 воротки к химерному белку (мол. мае. 145-150 КД), который появляется в лизате клеток E.coli, трансформированных реком- бинатной плазмидой ЗбК-pvH, а также к /3- галактозидазе, полученной из лизатов 0 клеток E.coli, трансформированных исходной плазмидой pUR 290.

Полученные антисыворотки реагируют в РИА с бактериальными лизатами, содержащими химерный белок, показывая титры 5 1: 100. Антисыворотка, полученная к химерному белку в РИА не реагирует с оболочкой и сердцевиной вируса, но реагирует с лизатами и мембранами инфицированных клеток.

0Для идентификации продукта гена 36К

проводят радиоиммуноблотинг различных фракций вируса осповакцины, лизатов и мембран инфицированных и неинфицированных клеток cv-1 с антисывороткой к хи- 5 мерному белку.

По радиоавтографу определяют, что данная антисыворотка связывается с белком с мол. м. 36 КД, содержащимся в лиза- тах и мембранах инфицированных клеток, и 0 не связывается с различными фракциями вируса. Наблюдается незначительное неспецифическое связывание с сердцевинными белками вируса в области 62 и 58 КД. Это свидетельствует о том, что химерный блок 5 яаляется иммуногенным и обладает вирусной специфичностью.

Таким образом, изобретение позволяет получить иммуногенный вирусный белок 36К, который может быть использован для

получения антисыворотки к этому белку, а также для тестирования антител, появляющихся при иммунизации вирусом осповак- цины.

Формула изобретения 1.РекомбинантнаяплазмиднаяДНК36К- pvH, кодирующая синтез иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма ЛИВП, размером 6754 п.н. и мол.м. 4,5 МД, содержащая Cla I - Hind III - фрагмент вектора pUR 290 размером 6725 п.н. и мол. м. 3,8 МД, Hind III - Bsp Rl - фрагмент ДНК вируса осповакцины с геном белка 36К размером 1029 п.н. и мол.м. 0,69 МД;

сайты для эндонуклеаз рестрикции:

по три участка расщепления рестрикта- зы EclRI, Cla I.

два участка расщепления рестрикта- ции Bam HI ,

по одному участку расщепления ре- стриктаз Hind Ml, Pst I. Sal I,

генетические маркеры:

-Apr - ген устойчивости к ампициллину;

-lac Z - ген / -галактозидазы.

2. Штамм бактерий Escherichia coll ВКПМ В-4743 - продуцент иммуногенного белка 36К вируса осповакцины штамма 15 ЛИВП.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии и медицине. Целью изобретения является создание штамма E.COLI - продуцента иммуногенного белка 36 К вируса осповакцины штамма ЛИВП. Сконструирована векторная плазмида 36 К - PVH, содержащая FLA - ген, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, и ген LAC Z с собственным промотором. При трансформации клеток E. COLI ВМН 71 - 18 плазмидой 36 К - PVH получают штамм - продуцент химерного белка, который обладает вирусной антигенной специфичностью, связывается с антителами сыворотки крови от переболевших животных и может быть использован для диагностических целей. Химерный белок является иммуногенным. Штамм бактерий, содержащий плазмиду 36 К - PVH, задепонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В - 4743. 2 с.п.ф-лы, 1 табл.