Способ определения танинофильности белков Советский патент 1991 года по МПК C07K2/00 C07K1/14 

сл С

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков. Целью изобретения является упрощение и удешевление анализа. Способ осуществляется следующим образом. Распознавание танинсвязанных белков проводят после добавления различного количества танина в раствор многокомпонентной системы белков, электрофореза в полиакриламидном геле и проявлением белков раствором трихлоруксусной кислоты. Денситометрирование гелей позволяет выявить соотношение танинофильных и танинофобных белков. 2 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биохимии, молекулярной биологии и биоорганической химии, и может быть использовано при изучении структуры и функции белков, при исследовании модельных систем полифенолов и белков.

Цель изобретения - упрощение и удешевление анализа.

Танины - полифенольной природы соединения, найденные в большинстве растительных тканей, обладают способностью связывать и осаждать белки

Способ состоит в том, что используют различные концентрации танина, которые добавляют к исследуемым белковым пробам, с последующим электрофоретическим определением белково-титановых комплексов.

Пример1.Из тонко размолотых зерен пшеницы и ячменя берут навеску 500 мг, приливают 5 мл 70%-ной этанола и экстрагируют белок при встряхивании в течение 1 ч. После центрифугирования при 7000д 15 мин надосадочную жидкость сливают в фарфоровую чашку и упаривают под феном до 1/3-1/4 первоначального обьема. В полученный раствор добавляют сухую мочевину и сахарозу до 6 М и 20% соответственно, и определяют концентрацию белка по связыванию с красителем амидо черным 105. После этого раствор делят на аликвоты по 200-250 мкл и в каждую добавляют танин возрастающих концентраций, ведя расчет на 500 мкг белка . 2, 5. 10. 15 20, 25 мг танина. В контрольный образец танин не добавляют. После полного растворения танина (30 мин) белки в трехкратной повторО

о

00

кэ

ности подвергают электрофорезу в 7,5% ПААГ с 6 М мочевины в стеклянных трубках диаметром 5 мм и длиной ВО мм. На трубку наносят 180-200 мкг белка. Первые 30 мин электрофорез ведут при силе тока 2 мА на трубку и последующие 1,5 ч - при силе тока 4 мА на трубку. После ркончания электрофореза гели опускают в 10%-ный раствор трих- лоруксусной кислоты на 1,5-2 ч и сканируют на денситометре. Относительное содержание белковых субфракций определяют, суммируя площади соответствующих пиков и вычисляя долю каждого из них, приняв сумму за 100%.

П р и м е р 2. Из.зерна кукурузы удаляют зародыш, эндосперм размалывают до тонкого порошка и на 1 г муки приливают 10 мл 70%-ного этанола, содержащего 2 М мочевины. Экстракцию белков прозодят в течение 1 ч при 60°С. После центрифугирования при 7000д 15 мин надосадочную жидкость упаривают под феном до 1/4-1/5 первоначального объема, добавляют сахарозы до 20%-ной концентрации и определяют белок по связыванию с красителем амидо черным 10Б. Танин добавляют в различных количествах, как описакто в примере 1.

Электрофорез белков проводит в 7,5% ПААГ с 8 М мочевины. Остальная процедура аналогична описанной в примере 1.

П р и м е р 3. Зерно сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 2 г и приливают 20 мл 70%-ного изопропанола с 4 М мочевины, предварительно проведя экстракцию холодной водой Белки солюбилизиру- ют в течение 1 ч при 60°С. После центрифугирования и упаривания до 1/5- 1/6 первоначального объема в растворы

Субфракция гпиадина пшеницы (Богарная 56

иг

f ft

оС

Субфракция гордеина ячменя (Днепровский 435)

. Г f оС

белков добавляют сахарозу и проводят дальнейшие операции, как описано в примере 2. .

Проведенные исследования показывают, что воздействие танина на различные субфракции белков крайне неодинаково. Результаты количественного соотношения белковых субфракций пшеницы, ячменя, кукурузы и сорго при различных концентрациях танина представлены в табл. 1 и 2, Из данных та.бл.1 и 2 следует, что наиболее чувствительными к действию танина (тани- нофильные белки) являются о -субфракции пшеницы и ячменя, и А - субфракции кукурузы и сорго.

Использование предлагаемого способа распознавания танинсвязывающих белков по сравнению с известными позволяет дифференцировать белки по их способности

связываться с танином в многокомпонентной системе, а также количественно вычислять соотношение танинофильных и танинофобных белков.

Формула изобретения

Способ определения ганинофильности белков, включающий исследование взаимодействия белков с танинами в многокомпонентной системе с последующим учетом

результатов, отличающийся тем, что, с целью упрощения и удешевления анализа, при исследовании взаимодействия к белковым пробам добавляют градиентное количество танина, проводят электрофорез белков

в полиакриламидном геле, после чего денси- тометрически определяют количественное соотношение белковых компонентов, по которому судят о степени танинофильности.

Таблица

Субфракции зеина кукурузы (Грушевская 380)

А Б С D

Е

Субфракции кафирина сорго (Низкорослое 93Ф)

А В С D Е