Способ получения десульфатогирудина Советский патент 1991 года по МПК C12N15/15 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках.

Цель изобретения - повышение выхо-1 да целевого продукта.

Способ заключается в том, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую гибридные промотор PH05-GAPDH, состоящий из Clo-SatI РН05, промоторного фрагмента плазми-, ды р 31/Y размером 545 Ър, связанного синтетическим1 линкером Bglll с Bglll- EcoRIGAPDH промоторным фрагментом - - плазмиды pGAI)H размером 266 bp Sal I- Hind Ill-фрагмент ппазмиды pIDB207/ /205-HIP размером 6,3 kb и EcoRI-HfndITJ-фрчгмент плазмиды pJDB207/pH05(FC:0)HTR размером 643 bp(

содержащий дисульфатогирудин Hgal- BamIII-фрагмент плазмиды p IL310L размером 0,2 kb трансформируют полученной рекомбинантной плазмидной ДНК штамм дрожжей S.cerevisiae GRIM8, культивируют трансформированные клетки, в жидкой культуральной среде, содержащей 0,03 г/л дегидрогенфосфата калия.

Пример 1. Конструирование РН05 промоторных делеций.

а) ВаЗЗ расщепление. Рекомби- нантный фаг М13мр9/НР05 Barn-Sal, содержащий БашНТ-ЯаИ-фрагмент РН05, используют в качестве источника РН05 промотора. 20 кг фага ДНК (RF: репликативная форма) расщепляют ре05

со о о

CD

с

стрикционной эндонуклеазой Sail, получая линейную ДНК приблизительно

9kb, После экстрагирования смесью фенол/хлороформ ДНК осаждают этано- лом. ДНК повторно суспендируют в

10мК трис, рН 8,0, в концентрации 0,5 мкг/мл. 16 мк ДНК, отщепленной Sail, расщепляют 2 eg экзонуклеазы BA131(BRL) в 100 мл 20 мМ трис, рН 8,0, 199 мм NaC, 12 мМ MgCl,

2 мМ CaClЈ и 1мМ ЭДТА. Аликвотные части 2 мкг ДНК каждая отбирают после 1, 2, 3, 4, 5 и 6 мин инкубирования при ЗП°С и немедленно смешивают с 50 мкл фенола и 60 мкл TNE. После экстрагирования смесью фенол/хлороформ и осаждения этанолом, ДНК повторно суспендируют в 1 0 трис, рН 8,0, при концентрации 100 мкг/мл, Для анализа степени экзонуклеолити- ческого отщепления Ва131 0,Ь мкг ДНК для каждого момента времени расщепляют эндонуклеазой ВатНТ и анализируют на 1,5%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере, рН 8,3 (90 мМ трис-IICl, рК 9,3, 90 мМ борной кислоты, 2,5 мГ1 ЕДТА) . В среднем 100 Ьр удаляют с каждого конца фрагмента за 1 мин Ва131 расщепления.

б) Добавление EcoRI линкеров к обработанной Ва131 ЛНК. Дне ец. EcoRI линкеров (5 -GGAATTCC-3 , BRL) повторно суспендируют в 250 мкл 10 мМ трис-HCl, рН 8, 1 мМ ЕДТА. 2 мкг EcoRI линкеров обрабатывают киназой в в 75 мкл 60 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgClfc, 15 Mil ДДТ, 10 мкМ АТР и 33 ед.т4 полинуклеотидной киназы. Через 1 ч при 37°С смеси дают остыть до комнатной температуры, а затем хранят при -20°С.

Отожженные двунитевые EcoRI линкеры связывают тупыми концами с ДНК- фрагментами, обработанными Ва131, 0,5 мкг ДНК, обработанной Ва131, инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре с 50-кратным избытком EcoRI линкеров, обработанных киназой и 20 мкл 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgClfe, .10 ДТТ, 4 мК АТР и 600 ед.Тц ДКК-лигазы. После инактивирования Т. лигазы (10 мин при ) избыток EcoRI линкеров отщепляют 50 ед, EcoRI в- Объеме 50 мкл. ДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ, .осаждают этанолом и повторно суспендируют в 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЕДТА (-ТЕ). Затем ДНК отщепляют 5 ед. BamHI и полученную

смесь вносят в 1,5%-ный агарозный гель с низкой температурой плавления i в трис-боратном буфере. Полосы окра-/ шивают этидиумбромидом и визуализируют длинноволновым УФ-светом при 366 нм. Широкие диффузные полосы между около 100 п.о. и 600 п.о. вырезают из геля, и ДНК экстрагируют.

. в) Дотирование в М13мр9. 3 мкг Ml Змр9 расщепляют 15 ед. EcoRIи 15 ед. BamHI в объеме 50 мкл. После экстрагирования фенолом и осаждения этанолом ДНК повторно суспендируют в 50 мкл ТЕ. 5 мкл отрезков векторной ДНК (около 200 нг) смешивают с 10 мкл указанных образцов (ДНК-фрагменты, полученные из различных Ва131 переваров, как описано в примере 16) и лигируют в полном объеме 20 мкл в присутствии 60 мМ трис-HCl, рН 7,5,

6 мМ MgClii, 100 мМ ДТТ, 1 мМ АТР и и 200 ед.Т ДНК-лигазы в течение 15 ч проводят трансдукцию компетентных клеток штамма E.coli M101. Фаги выращивают и анализируют по размеру их ДНК-вставок путем отщепления ре- стрикционными ферментами EcoRI и BamHI.

г)Определение Ва131 конечныхточек делеции определением последовательности аминокислотных остатков по Сангеру (делеции Sail сайта). Определение последовательностей проводят, используя систему дидеокси-ДНКопределения последовательностей. Конечные точки делеции приведены в табл.1.

д)Определение Ва131 конечных точек делеции определением последова- тельности аминокислотных остатков по Сангеру (делеции от BamHI сайта). Осуществляют аналогичный набор Ва13) делеции, как описано в пунктах а-в за исключением того, что М13мр9 РН05 Barn-Sal вырезают с помощью BamHI. Ва131 расщепленные фрагменты обрабатывают EcoRI и Sail, и полученные фрагменты клонируют в MlЗмр9 расщепленный EcoRI и Sail. Конечные точки делеции приведены в табл.2,

е)Конструирование внутренних РН05 промоторных делеции. Набор Ва13Г делеции, описанный под пунктом г, приводит к получению левых РН05 промоторных фрагментов, заканчивающихся EcoRI сайтом, а Ва131 набор делеции, описанный в пункте д, приводит к получению правых РНС5 про 163061

моторных фрагментов, заканчивающихся EcoRJ-сайтом. Комбинируя левые и правые в различных положениях создают внутренние делеции, которые содержат EcoRJ линкерный сегмент по сайту делетированной ДНК. Отдельные внутренние делении конструируют, вырезая левые и правые из М13мр9 производных рестрикционными эндонук- -jo леазами EcoRI и BamHI (левые) или EcoRI и Sail (правые) и выделяя соответствующие Фрагменты с помощью электрофореза в мягком агарозном геле, как описано в пункте б. Эквимоляр- з ные количества левых, правых и 200 нг BamHI и Sail расщепленных М13мр9 векторных ДНК лигируют, как описано в пункте в. После трансдук- ции в E.coli Ml01 белые пятна отби- 20 рают, определяют RF и анализируют рестрикционным ферментативным анализом (BamHI, Sail, EcoRI). Куски, приведенные в табл.3, объединяют для создания специфических внутрен- 25 них делеции.

Пример 2. In vivo анализ внутренних делеции РН05 промотора.

Различные делеции, описанные в 30 примере 1, клонируют в плазмиду pJDB207(PH05), заменяя дикий тип РН05 Barn-Sal Фрагмента делетирован- ным вариантом. После трансформации дрожжевого штамма S.cerevisiae AH216. определяют активность кислой фосфа- тазы. Анализ показьюает, что три зоны, существенные для РН05 экспрессии, расположены в следующих положениях:40

1.между положениями -349 и -383 (HAS1);

2.между положениями -225 и -263 (HAS2);

3.между положениями -87 и ,с -125 (ТАТА бокс).

ДНК фрагменты, содержащие HAS или ИА52 или HAS1 и ИА52 РН05 можно получить из рекомбинантного бага М13мр9 (РН05) путем отщепления соответствую- 50 щими эндонуклеазами.

Пример 3. Конструирование слитых PH05-GAPDH гибридных промоторов.

В примерах 1 и 2 конструируют участки вокруг положений -365 ИА51 (РН05) и другой участок вокруг положения -180 ИА82 (РН05) РН05 гена - возможные кандидаты для HAS с регули35

55

з 0 5

0 0

с

0

5

5

руемыми функциями. HAS (PH05) содержится в 68 п.о. BamHI-Cla-фрагмен- те, тогда как оба ИА51 (РН05) и Ш52 (РН05) содержатся в 368 п.о. BamHI-BstEII-фрагменте. Каждые два этих фрагмента сливают с двумя различными GAPDH, которые включают ТАТА бокс и сайты инициирования транскрипции GAPDH.

а)Конструирование дрожжевой генной библиотеки 30 мкг полной высокомолекулярной ДНК дрожжей дикого типа штамма S288C инкубируют в течение

30.мин при с 2 ед. EcoRI мети- лазы в 250 мкл EcoRI буфера метилирования. ДНК осаждают этанолом, повторно суспендируют в 500 мкп 25 мМ трис-HCl, рН 8,5, 2 мМ MgCla (EcoRF буфер) и расщепляют EcoRI до тех пор, пока не получат распределение фрагментов ДНК по размерам с максимумом в области 30-50 т.п.о. Дрожжевые ДНК, расщепленные в условиях EcoRI , Фракционирую по размерам в градиенте сахарозы (5-20% сахарозы в 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЕДТА). 30 фракций по 0,4 мл каждая собирают с верхнего значения градиента. Фракция 16 содержит ДНК-фрагменты размером по 30-40 т.п.о. ДНК этой фракции 3 мкг осаждают этанолом и лигируют в течение 16 ч при 15°, в полном объеме 15 мкл с 15 мкг космидно- го вектора pYcTf линеаризированного EcoRI. Лигирование проводят 300 ед.Т ДНК-лигазы, используя описанную буферную систему. ДНК упаковывается in vitro в бактериофаг /1/В, а собранные фаги используют для трансдукции

Q f

E.coli штамма НВ101 (rk , mk , 1m , pro , гёс А), Эффективность трансдукции составляет около 5000 устойчивых к ампициллину колоний на мкг рУс вектора.300 amp колоний отбирают и выращивают в LB среде.

б)Выделение дрожжевого GAPDH гена. Описанную генную библиотеку скринируют синтетическим олигонукле- отидом следующего строения: 5 - ССТССАТСТТССАССССССС-31 .

10 мкг олигонуклеотида обрабатывают киназой, используя 10 мклОГ32р-АТР (3000 Кюри/ммоль, 10 мкКюри/мкл Тф полинуклеотидной киназой. Положительное клонирование детектируют ав- торадиографически. Выдепение плазмид- ной ДНК приводит к получению гибрид- ного клонаt который содержит

20

25

2100 п.о. Hindi фрагмента, кодирующего GAPDH. Клонированный GAPDH , ген имеет ту же самую последователь ность, что и pgap 491.5

в) Получение GAPDH расположенных ниже промоторных. 649 п.о, Tagl-фрагента, который включает положения от 27 до 675 от ATG GAPDH гена выдеяют, расщепляя гибридную плазмиду 10 Tag, выделяя ДНК-фрагмент на 1,2%- ном мягком агарозном геле и экстрагируя ДНК горячим фенолом. Клонирование Tagl-фрагмента проводят в Clal- сайт pBR322. 1 мкг pBR322 отщеп-г 15 яют тремя единицами Clal. 300 нг ли- гируют примерно с 300 нг вставки ДНК (649 Ьр Тг 1 фрагмент), используя 200 ед.Т ДНК-лигазы в 20 мкл. Трансформирование проводят в E.coli НВ101 на устойчивость к ампициллиу. ПЛазмидную ДНК получают и анализируют рестрикционным анализом. Ориентацию Tagl-фрагмента устанавливают, используя рестрикционную эндонуклеазу Пга в сочетании с BamHI. Выбирают плазмиду, которая содержит TagI сайт положения -675 вблизи HindIII-сайта pBR322. Эту плазмиду, обозначенную pBP322/GAPDH, линеаризируют, исполь- 30 зуя BamHI, а расщепление Ва131 осуществляют, как. описано в примере 1, за исключением того, что используют BglII-линкеры. Размер Ва131 укороченного Tagl-фрагмента определяют 35 рестрикционным анализом (используя Bglll и-HindIII).

Пример 4. Экспрессирова- ние десульфатогирудина, контролируемое PH05-GAPDH гибридным промотором. 40

I. Регулирование нуклеотидной последовательности на 5 -окончании де- сулъфатогирудиночого Н, V, R гена.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая десульЛатогирудин., начинается с GTT-кодона, стоящего после NH -терминального валина в конечном продукте. Для удобного субклонирования и экспрессирования в E.coli ко- дирующую последовательность продолжают на 5 -окончании с помощью восьми нуклеотидон, включающих EcoRI-or- раничительный участок и ATG-иницииру- ющий кодон. Для точного скелетного i слияния гирудиновой кодирующей последовательности с последовательностью кодирующей РН05 сигнальный пептид, эти дополнительные нуклеотиды удаля-

0

5

0 5 0 5

0

ют путем измерения EcoRI-ограничитель- ного участка в участок растущего окончания, добавления синтетического олигонуклептида, содержащего участок распознавания HgAI в таком положении, что последующее расщепление с помощью Hgal происходит непосредственно сверху от GTT-кодона, . Ведение Hgal ограничительного участка перед десульфатогирудиновым геном, 8 мкг плазмиды pML310 (ЕР 168342) исчерпывающе расщепляют с помощью ограничительной эндонуклеа- зы EcoRI ДНК, экстрагируют системой фенол/хлороформ и осаждают этанолом. Выступающие концы в положении 5 удаляют нуклеазой S,. ДНК рМЪЗ10/EcqRI в количестве 4 мкг расщепляют в 100 мл смеси, состоящей из 250 мМ NaCl, 1 мМ ZnSO, 30 мМ ацетата натрия при рН 4,6 с помощью 20 ед,/мл нуклеазы S (Сигма) в течение 45 мин при 37°С.

ДНК экстрагируют смесью фонол/хлороформ и осаждают этанолом. ДНК (pML310/EcoRI/Si повторно суспендируют в 100 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 8,0, и инкубируют в присутствии 2 ед, щелочной фосфа- тазы кишечника теленка в течение 1 ч при 37°С. Энзим инактивируют в течение 1,5ч при 65°С, Концентрацию NaCl в инкубационной смеси устанавливают равной 150 мМ, Дефосфорилированную ДНК (рМЬЗЮ/ i- EcoRI/S /CIAP) очищают путем адсорбции на ионообменной .колонке ДН52 в буфере с низким содержанием солей (150 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА) и затем элюируют буферным раствором с высоким содержанием солей (1,5 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЕДТА). ДНК осаждают этанолом и повторно суспендируют в HgO в концентрации 0,8 мг/мл..

Олигонуклеотид формулы 5 - AGCGT.CGACCCT-3 синтезируют1 фосфотри- эфйрным методом. Получают самокомплементарную последовательность олиго- нуклеотидов, содержащую участок распознавания -GACCC-ограничительной эндонуклеазы HgAI. Отжиг двух одинар- ных нитей приводит к получению дву- нитевой ДНК-связки из 12 пар азотис- - тих оснований.

Синтетический однонитевой олиго- деоксинуклеотид в количестве 1,2 мкг

фосфорилируют в 10 мкл системы, состоящей из 60 мМ трис-HCl с рН 7,5, 10 мМ MgClfc, 5 М МДТТ, 30.1 Ci (ft-32p ATP (30QO Ci ммоль 1 и 6 ед.Т4 поли- нуклеотидекиназы в течение 30 мин при 37 С с последующим замещением в течение 15 мин в присутствии 0,5 мМ АТР. Полученную смесь дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 75°С с целью инактивации энзима и затем охлаждают до комнатной температуры для отжига.

Меченную по iZP ДНК-связку в количестве 0,6 мкг (170 лмоля) смеши- вают с 2,4 мкг (1,75 пмолей концов) pMl310/EcoRI(S,,)CIAP и лигатируют в 20 мл смеси, состоящей из 60 мК трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgClg, 5 мМ ДТТ, 3.5 мМ АТР 800 ед.Т4 ДНК-ли- газы, в течение 20 ч при 150°С. Лига зу инактивируют в течение 10 мин при 85°С и избыток молекул связки удаляют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА с рН 7,5, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0 и 0,54 объемов изо- пропанола. Через 30 мин пребывания при комнатной температуре ДНК суспендируют в 45 мкл лигатационной смеси и лигнируют в течение 6 ч при с образованием кольцевой ДНК.

Аликвоты лигазной смеси объемами 1 и 3 мл добавляют к 100 мл обработанных кальцием трансформационных копетентных клеток E.coli HB101. Клет- ки оставляют охлаждаться во льду на 30 мин, затем инкубируют в течение 3 мин при 4.°С, охлаждают в течение 2 мин во льду и инкубируют в течение 1 ч при 37°С в 400 мкл среды SOS. Полученные клетки концентрируют до объема 100 мкл и наносят на пластины с LB агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

iо

Двенадцать трансформированных агар

колоний индивидуально выращивают в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, Готовят плазмидную ДНК, Наличие синтетической олигонуклеотид ной связки подтверждают определением последовательности аминокислотных остатков с использованием фрагмента однонитевой ДНК-затравки, которая гибридизуется с кодирующей нитью гирудина. Клон, который содержит ДНК-связку в правильнрм положении впереди гирудинового гена, обозначен как pML310L,

5 0

5 0

5

Q

5

II. Слияние РН05 сигнальной по- . следовательности десульфатогирудино- вого структурного гена.

а7 Выделение десульфатогируди- нового фрагмента. 12 мкг ДНК-плазмиды pL310L исчерпывающе расщепляют эндо- нуклеазами БатК и Pyul. После экстракции ДНК два указанных ограничительных фрагмента отделяют, в 1 ,2%- ном агарозном геле в трис-борат-ЕДТА буфере, рН 8,3, Из геля выделяют Pyul-BamHI-фрагмент размером 0,84 п,о, ДНК элюируют, Pyu-BamHI-фрагмент pM1310L дополнительно расщепляют с помощью эндо- нуклеазы Hgal. В результате расщепления образовывается HgaI-BamHI-фраг- мент размером 198 п.о,, который содержит полную кодирующую последовательность для зрелого десульфатоги- рудина. Дополнительное расщепление с помощью А1И1 не затрагивает этого фрагмента, но устраняет другой Hgal- фрагмент аналогичного размера.

Нужный KgaI-BamHI-фрагмент отделяют от других фрагментов на 1,5%-ном агарозном геле в ТВЕ буфере и элюи- руют. ДНК очищают ионообменной хроматографией, осаждают этанолом, ДНК повторно суспендируют в HgO в концентрации 30 мкг/мл (0,2 пмоль/мкл)..

Выделение РК05 промоторного участка с частью РН05 сигнальной последовательности. Плазмида р31/РН05-ТРА18 имеет-РН05 промотор и РН05-сигналь- ную последовательностьt скелетно связанную с инородным структурным геном (t-PA). Фрагмент 584 п.о. BamHI-Ball содержит РН05-промотор и всю РН05-сиг- нальную последовательность, но с восемью нуклеотидами на 3 окончании.

р31/РН05-ТРА18 ДНК в количестве 8 мкг расщепляют эндонуклеазой Ball (16 ч при 37ЙС). ДНК очищают .экстракции смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом, ДНК повторно суспендируют в при концентрации 0,7 мг/мл.

Правильное соединение между РН05 сигнальной последовательностью и кодирующим участком десульфатогирудина обеспечивается синтетической связкой формулы:

(1)5 -CCAATCGA-3 ;

(2)3 -GGTTAGGT СААСА-5 .

Восемь нуклеотидов на 51 окончании связи (S -CCAATCCA) представляют собой часть РН05-сигнальной последовательности от участка Ball до рецессионного участка. Пять нуклео- тидов, выступающих над окончанием 5 - олигонуклеотида(2), соединяются с частком HgAI расщепления на 5 . кончании десульфатогирудиновой одирующей последовательности.

Индивидуальные однонитевые олиго- уклеотиды (1) и (2) синтезируют JQ осфотриэфирным методом. Олигонук- еотиды (1) и (2) в количестве

1,1 мкг и 1.8 мкг соответственно инfивидуально фосфорилируют на их 5

кончаниях, смешивают в эквимолярных 15 оличествах и отжигают.

Фосфорилированную двунитевую ДНК-связку в количестве 1,3 мкг (200 пмоль), лигиругот с 7 мг (1,8 пмоль) рЗГ/РН05-ТРА18 расщепленной с помо- J 20 щью Ball в 40 мл смеси, состоящей из 60 мМ трис-KCl, рК 7,5, 10 мМ MgCl2, 3,5 мМ АТР, 5 мМ ДТТ и 1400 ед.т ДНК-лигазы, при в течение 16 ч. Лигазу инактивирз ю г в течение 1 0 мин 25 при 85 ЙС. Избыток связок удаляют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола. ДНК повторно суспендируют и дополнительно 30 расщепляют эндонуклеазой BamHI. После экстракции ДНК смесью фенол/хлороформ и осаждения из этанола два указанных ограничительных фрагмента отделяют в 1,2%-ном агарозном геле в 35 трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3. Из геля выделяют 0,6 т.п.о. фрагмент. , ДКК элюируют и дополнительно очищают ДЕ52 ионообменной хроматографией и осаждением этанолом. RamHI-Hgal 40 ДНК-фрагмент размером 0,6 т.п.о, повторно суспендируют в при концентрации 40 мкг/мл.

Выделение pJDB207 дрожжевого векторного фрагмента. 9 мкг плазмиды Д5 pJDB207 РН05-ТРА(12-2) расщепляют эндонуклеазой BamHI, ДНК экстрагируют смесью фенол/хлороформ и осаждают этанолом, суспендируют в 50 мМ трис- НС1; рН 8,0, при концентрации о 0,1 мг/мл и расщепляют 7 ед. щелочной фосфатязы кишечника теленка в течение 1 ч 37°С. Фосфатазу инак- тивировали в течение 1,5 ч при 65°С. ДНК очищают ДЕ52 ионообменной хро- „ матографией и осаждением этанолом. Крупный фрагмент BamHI размером 6,8 т.п.о. отделяют в 1,2%-ном агарозном геле в грис-Гюрат-ЭДТА буфере при рН 8,3. ДНК элюируют и очищают с помощью ДЕ52 ионообменной хроматографии и осаждением этанолом. ДНК растворяют в воде в концентрации 0,4 мг/мл (0,1 пмоль/мкл).

Лигатирование РН05 промоторного фрагмента и десульфатогирудинового структурного гена с pJDB207. Дрожже- вой вектор pJDB207, РН05-примотор- ный фрагмент с РН05-сигнальной последовательностью и десульфатогируди новый структурный ген выделяют в виде фрагментов ДНК и лигируют их с образованием экспрессионной плазми- ды.

В течение 20 ч при 15°С в 10 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ MgCLa, 5 мМ ДТТ, 1 мМ АТР и 400 ед.Тц ДНК-лигазы, проводят лигирование 0,3 пмолъ 0,6 т.п.о, BaHI-Hoal фрагмента р31/РН05-ТРА18 и 0,3 пмоль 0,2 т.п.о. Hoal-BaHI фрагмента рМ13101 с, 0,1 пмоль 6,8 т.п.о. BamHI фрагмента pJDB207P/PH05-TPA(12 2).

Аликвоту лигазной смеси объемом 1 мкл добавляют к 100 мкл трансформационных компетентных клеток E.coli НВ101, Клетки высевают на LB-arapo- вые пластины, содержащие 50 мкг/мл ампициллина,

R

Арт колонии в количестве 24 ед, индивидуально выращивают в LB-среде в присутствии 100 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируют с целью определения размера и ориентации вставки путем расщепления ограничительной эндонуклеазой Pstl. Клон с правильной ориентацией вставки обозначают как pJDB207/PH05-HIR.

Получение плазмиды pJDB207/PH05/ (Eco)-HIR, С целью удобного соединения элементов YAS(PH05)GAPDH гибридного промотора с кодирующим участком десульфатогирудина, включающим РН05-сигнальную последовательность (как и в плазмиде pJDB207/PH05-HIR) EcoRI ограничительный участок вводят в 5 нетранслированную область между исходными участками RHK и АТС кодирующей области.

15 мкл плазмиды pJDB207/PHO-HRI расщепляют эндонуклеазой Dral, Полученные в результате четыре фрагмента отделяют в 0,8%-ном агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере при рН 8,3. С геля регенерируют фрагмент ДНК размером 4,2 т.п.о., подвергают элюированию и осаждают этанолом. ДНК нов- торно суспендируют в концентрацией 0,6 мг/мл.

Каждый из двух синтетических

олигонуклеотидов, отвечающих формулам 5 -AATTCGATTACCAATGTTT-3 и 3 -GCTAATGGTTACAAA-5 . (2,3 мкг и 2,9 мкг соответственно) , подверга- ют действию киназы в 20 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ Mp.de, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР и 20 ед.Т полинуклеотидокиназы. Через 45 мин при 37°С обе реакционные сме- си объединяют, нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной температуры. Отожженную олиго нуклеотидную связку хранят при -20 С.

Фрагмент размером 4,2 -т.п.о. DrAT ДНК в количестве 6,5 мкг (2,3 пмоль) инкубируют в течение 16 ч при в присутствии 70-кратного избытка ки назированной и отожженной олигонук- леотидной связки в 50 мкл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgClu, 5 мМ ДТТ, 3,5 мМ АТР и 800 едЛ 800 ед.Тф ДНК-лигазы. После инактивации Тф ДНК-лигазы в течение 10 мин при избыточные связки удаляют осаждением ДНК в присутствии 10 мМ ЭДТА, 300 мМ ацетата натрия с рН 6,0 и 0,54 объема изопропанола. ДНК расщепляют эндонуклеазами EcoRI и Hindlll, Полученные в результате фрагменты отделяют в 1%-ном агароз- ном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3. Фрагмент размером 643 элюи- руют и осаждают этанолом, повторно суспендируют в концентрации 0,1 п моль/мл. Фрагмент EcoRI-Hindlll содержит РН05 сигнальную последовательность, кодирующую последовательность десульфатогирудина и обрыва- тель РН05 транскрипции.

Из плазмиды р31 /R выделяли 534 п.о РН05-промоторный фрагмент. 10 мкг рЗ1/R расщепляют эндонуклеазами EcoR и BamHI, Три фрагмента отделяют в 0,6%-ном низкоплавком агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, BamHI-EcoRI-фрагмент размером 534 п.о содержит РН05 промотор, включающий

исходные участки mRHK.

i

6 мкг плазмиды pJDB207/PH05-HIR

расщепляют с помощью BamHI и Hindlll Крупный 6,5 т.п.о, фрагмент отделяют от других фрагментов в 0,6%-ном . агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере, рН 8,3.

Три описанных фрагмента ДНК с соответствующими липкими концами лиги- руют ТУ ДНК-лигазой в соотношении 534 п.о. BamHI-EcoRI РН05-промоторно- го фрагмента 0,2 пмоль, 643 п.о. EcoRI-HindIII-фрагмента (последова- - тельность кодирующая гирудин ) 0,2 пмоль, 6,5 т,п.о, BamHI-Hindlll векторного фрагмента 0,1 пмоль.

Аликвоту лигазной смеси в количестве 1 мкл добавляют в 100 мкл обработанных кальцием трансформационных компетентных клеток E.coli HB01.

ь

Двенадцать трансформированных amp колоний индивидуально выращивают в LB-среде, содержащей 10 мкг/мл ампициллина, Плазмидную ДНК анализируют с помощью EcoRI и BamHI ограничительного расщепления. Выделяют один клон с ожидаемыми ограничительными фрагментами и обозначают pJDB207/PH05 (Eco)-HIR.

IV. Лигатирование YAS1 (РН05)- GAPDH гибридных промоторов с областью десульфатогирудина, кодирующей белок.

15 мкг плазмиды pJDB207/FH05 (Eco)- HIR расщепляют с помощью EcoRI и Hindlll. Фрагменты ДНК отделяют в 1%-ном агарозном геле в трис-борат- ЭДТА буфере, рК 8,3. Фрагмент 643 п.о. элюируют и осаждают этанолом, суспендируют в HjO в концентрации 0,1 пмопь/мкл. 6 мкг плазмиды pJDB207/PH05-HlP исчерпывающе расщепляют эндонуклеазой Hindlll и Sail. Крупный 6,3 т,п.о. фрагмент / векторная часть) выделяют электрофорезом, экстрагируют фенолом, осаждают этанолом, суспендируют в в концентрации 0,05 пмоль/мкл.10 мкл плазмиды pGAPDH-EI расщепляют с помощью Bglll и EcoRI, Фрагмент 266 п.о. Bglll-EcoRI отделяют на 1,2%-ном агарозном геле в трис- борат-ЭДТА буфере, рН 8,3, элюируют, осаждают этанолом, суспендируют в HgO в концентрации 0,3 пмоль/мкг. 0,3 пмоль 548 п.о. фрагмента Sall- Bglll, содержащего УА51 (РН05), 0,3 пмоль 266 п.о. BglII-EcoRI-фраг- мента pGAPDHEI, 0,3 пмоль 643 п.о. ЕсоЕ1-Н1паШ-фрагмента рЛ)В207/РН05 (Eco)-HIR и 0,12 пмоль 6,3 п.о. SailHindIII-векторного фрагмента лигиру- ют в 20 мкл смеси, состоящей из 60 ;мМ трис, рН 7,5, 10 мМ MgCle., 5 мМ ДТТ, I мМ АТР и 400 ед.Тц ДНК-лигазы1 в течение 6 ч при , Аликвоты ли- газной смеси объемами 1 мкл и 3 мкл добавляют к 100 мкл обработанных кальцием клеток E.coli HB101. Выделение плазмиды из атр колоний и ограничительный анализ с помощью Sail, Bglll, EcoRI и Hindlll проводят согласно описанному. Выбирают один положительный клон и ему присваивают обозначение pJDB207/PAPEI-HIR (YAS1). Аналогичную конструкцию создают с помощью 201 п,о. BgIII-EcoRI-фраг- мента, выделенного из pGAPDH-FI, Одной выделенной плазмиде дают обозначение pJDB207/PAPEI-HIR (YAS1). V. Лигирование YAS1 (PH05)-YAS2 (PHOS)-GAPDH гибридных промоторов с протеин-кодирующей областью десуль- фатогирудина. Плазмиды pJDB207/PAPEI10

лоний и анализируют ограничительным расщеплением. Выбирают единичные колонии и их плазмидные ДНК обозначают как pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2) и pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2).

Пример 5. 31 п.о. ДНК-последовательность является достаточной для выполнения функций фосфат-конт- ролирующего элемента.

31 п.о. последовательность из верхней области РН05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченная двумя боковыми делециями Д1 0 и /М 3 (пример 1е), может потенциально содержать регуляторный сигнал. Это предположение может быть проверено путем синтеза двух комплементарных олиго- нуклеотидов, имеющих следующие струк20 туры: 5ЧААТТССАААТАТАТАТТАААТТАССА

CGTTTTCGCAG-3 и З1 -GCTTTATATATAATTT AATCGTGCAAAA GCGTCTTAA-S .

Эта последовательность содержит

t5

/

31 п.о, последовательность% к кото-

HIR(YAs l)) HpJDB207/PAPEl HIR(YASl) 25 рОй прташают ЕсоК ограничительные

в количестве 3 мкг каждая расщепляют с помощью Bglll. После экстракции фенолом и осаждения этанолом 3 рецессивные окончания ДНК заполняют в реакции с E.coli ДНК-полимеразой (фраг- 30 мент Кленова), Энзим инактивируют в течение 10 мин- при . ДНК дополнительно расщепляют с помощью Sail и 7,2 т.п.о, фрагменты выделяют электрофорезом на мягком агарозном геле, 35 экстракцией фенолом и осаждением этанолом. Каждый фрагмент повторно сус- . пендируют в НгО в концентрации 0,05 пмоль/мкл. Такие фрагменты содержат гирудин-кодирующую область, 40 большинство векторных последовательностей и любой из двух различных GAPDH промоторных элементов, выде ленных из pGAPDH-EI или pGAPDH-FI,

участки. Такие участки EcoRI позволяют легко осуществлять полимеризацию последовательности с образованием

мультимеров.

а) Клонирование 31 п.о. элемента в вектор LT98. Каждый из двух синтетических олигонукле отидов, взятых в количестве 50 пмоль, обрабатывают 20 ед. ТЧ полинуклеотидокиназы в 20 мл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мК MgClfc, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, Через 45 мин инкубации при 37 °С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной .. температуры, Отожженные олигонуклео- тиды хранят при -200С. Киназированные и отожженные олигонуклеотиды в колиПлазмиду p31/Y расщепляют с помо- 45 честве пмоль лигируют в течение щью BstEII, инкубируют с помощью 30 мин в объеме, равном .15 мкл. Затем добавляют EeoRI-фрагмент LT98 векторной ДНК (0,075 пмоль) и. инкубиE.coli ДНК-полимеразы (фрагмент Кленова) согласно описанному и расщепляют с помощью Sail. Фрагмент 649 п.о. отделяют на мягком агарозном геле и регенерируют экстракцией фенолом и осаждением этанолом.

О.,3 пмоль Ь49 п.о, фрагмента р31/Ј включающего YAS1-YAS2 (РН05) промо- торный элемент и 0,15 пмоль каждого из 7,2 т.п.о. фрагментов лигируют и трансформируют в клетки E.coli НВ101. Плазмиды получают из amp ко50

55

руют в течение 6 ч. После трансформации клеток E.coli HB101 плазмиды выделяют и анализируют путем расщепления с помощью BamHI, выбирают индивидуальные плазмиды-с 1, 2, 3, 4 или 5 фрагментами EcoRI и проводят определение последовательности аминокис-. лотных-остатков (по методу Сангера),, Показано, что культиплетные 31 п,о. элементы клонированы в ориентации от головы к хвосту.

лоний и анализируют ограничительным расщеплением. Выбирают единичные колонии и их плазмидные ДНК обозначают как pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2) и pJDB207/PAPEI-HIR(YASl+YAS2).

Пример 5. 31 п.о. ДНК-последовательность является достаточной для выполнения функций фосфат-конт- ролирующего элемента.

31 п.о. последовательность из верхней области РН05-промотора (положение от -381 до -351), ограниченная двумя боковыми делециями Д1 0 и /М 3 (пример 1е), может потенциально содержать регуляторный сигнал. Это предположение может быть проверено путем синтеза двух комплементарных олиго- нуклеотидов, имеющих следующие струк0 туры: 5ЧААТТССАААТАТАТАТТАААТТАССА

CGTTTTCGCAG-3 и З1 -GCTTTATATATAATTT AATCGTGCAAAA GCGTCTTAA-S .

Эта последовательность содержит

5

/

31 п.о, последовательность% к кото-

5 рОй прташают ЕсоК ограничительные

участки. Такие участки EcoRI позволяют легко осуществлять полимеризацию последовательности с образованием

мультимеров.

а) Клонирование 31 п.о. элемента в вектор LT98. Каждый из двух синтетических олигонукле отидов, взятых в количестве 50 пмоль, обрабатывают 20 ед. ТЧ полинуклеотидокиназы в 20 мл смеси, состоящей из 60 мМ трис, рН 7,5, 10 мК MgClfc, 5 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТР, Через 45 мин инкубации при 37 °С обе реакционные смеси объединяют, нагревают в течение 10 мин при 75°С и охлаждают до комнатной .. температуры, Отожженные олигонуклео- тиды хранят при -200С. Киназированные и отожженные олигонуклеотиды в коли

руют в течение 6 ч. После трансформации клеток E.coli HB101 плазмиды выделяют и анализируют путем расщепления с помощью BamHI, выбирают индивидуальные плазмиды-с 1, 2, 3, 4 или 5 фрагментами EcoRI и проводят определение последовательности аминокис-. лотных-остатков (по методу Сангера),, Показано, что культиплетные 31 п,о. элементы клонированы в ориентации от головы к хвосту.

1716

б) Клонирование в pJDB207. Олиго- меры 3 п.о. испытывают на их промо- тор-контролирующую функцию путем их встраивания вверх от F элемента GAPD промотора. Плазмиду pJDB207/PAPEI- EGI(YASl) укорачивают с получением плазмиды с вычеркнутым элементом YAS1. Такую плазмиду расщепляют с помощью Sail и Bglll, очищают на геле и выделяют крупный векторный фрагмент, В независимой реакционной смеси эту же плазмиду расщепляют с помощью BamHI. Рецессивные З1 окончания заполняют ДНК-полимеразой Кле- нова, используя для этой цели все четыре НТФ. Участки с тупыми концами расширяют с помощью фосфорплирован- ньк BglII-связок и после расщепления с помощью Sail и Bglll путем очистки на геле выделяют ДНК фрагмент, имеющий приблизительную длину 400 п.о. Крупный векторный фрагмент лигируют с Sall-Bglll фрагментом длиной около 400 п.о. с использованием Тц ДНК-лигазы. После трансформации E.coli HB101 и выделения плазмиды получают плазмиду, не содержащую РН05 YAS. Такую плазмиду обозначают как pJDB207/GAPFI-EGI. Эту плаэмиду расщепляют с помощью Bglll и она служит вектором для клонирования 31 п.о олигомеров. 1 198, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5-олигонуклеотидных вставок, расщепляют с BamHI. Фрагменты различного размера выделяют очисткой в геле и независимо лигируют с pJDB207/GAPFI-EGi; разрезанной эндо- нуклеазой Bglll. Смесь расщепляют с Bglll для удаления нежелательного повторно лигированного вектора без ДНК-вставки и затем используют для трансформации E.coli HB101, Полученные плазмиды анализируют ограничительным аналичом с помощью Sail и Dral (участок внутри GAPDH промотор- ной части).

Пример 6. Экспрессия полипептидов.

Штамм CPF18 разновидности Saccha- romyces cerevisiae трансформируют полученными плазмидами.

Клетки трансформантов S.cerevisiae CPF18 выращивают в 10 мл среды Difco без аминокислот, в которой добавлено 2% глюкозы и 20 мг/л L-гистиди- на, в 50 миллиметровой Эрленмейеров- ской колбе, при встряхивании в тече5 0 о 5

0

5

ние 24 ч при 30°С до плотности 3x10 кл./мл. Эти клетки промывают 0,9%-ным раствором Nad и используют для инокуляции 50 мл минимальной среды с низким Р: ., полученной согласно рецепту для среды Difco Jeast Nitrogen Base (без аминокислот, но содержащей 0,03 г/л , I г/л КС1 и 10 г/л L-аспарагина вместо ( 2% глюкозы и 1 г/л L-гистидина). Культуры инокулируют до достижения плотности порядка 4x10 кл./мл и перемешивают со скоростью 200 об,/мин в течение 42 ч при 30°С.

Дрожжи секретируют десульфатоги- рудиновые соединения в культураль- ный бульон. После ферментации в течение 22 ч из культуральной среды отбирают образец объемом в 10 мл и его обогащают протеинами путем обес- соливания и концентрирования на колонке. Колонку дважды промывают 1,5 мл системы вода - ацетонитрил (9:1) - 0,1% трифторуксусной.кислоты. Десульфатогирудиновые соединения элюируют с колонки системой вода - ацетонитрил - 0,1% трифторуксусной кислоты (3:2 об./об,). Элтоат в количестве 2 мл концентрируют до конечного объема 400 мл, Десулх атогиру- дин идентифицируют анализом с применением жидкостной хроматографии высокого давления, проводя сравнение с аутентичным десульфатогирудином и с помощью пробы на ингибирование тромбина.

Полученные результаты представлены в табл о 4, Формула изобретения

Способ получения десульфатогируди- на, предусматривающий выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, конструируют ре- комбинантную плазмидную ДНК, содержащую гибридный промотор PH05-GAPDH, состоящий из Clal-Sall PH05 промотор- ного фрагмента плазмиды p31/Y размером 545 Ьр, связанного линкером Bglll с Bglll-EcoRI GAPDH промотор- ным фрагментом плазмиды pGADHs-разме- ром 266 Gbp, SalIr-HindIll-фрагмент плазмиды pJDB207/PH05-HIP размером 6,3 kb, EcoRI-HindIII-фрагмент плазмиды pJDB207/PH05(F,co)-HIR размером 643 Ьр, кодирующий десульфатогиру21

1630616

; 22

Продолжение табл.3

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению чужеродных полипептидов в дрожжевых клетках. Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что; конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую синтез десульфа- тогирудина путем объединения BamHI- Sall фрагмента векторной плазмиды р,Л)В20С размером 6,3 kb с гибридным промотором PH05-GAPDH, состоящим из BamHT-BstEHPH05-d parMeHTa плазмиды р 31/Y, связанного линкерами BglTI с промоторным фрагментом Bglll- EcoRIGAPDH плазмиды pGPDH-E и Hgal- BamKI-фрагментом плазмиды pMT350L размером 0,2 kb, кодирую;щм десуль- фатогирудин. Штамм Ј. cerevisiae GRF18 трансформируют полученной ДНК, культивируют клетки в среде, содержащей 0,03 г/л дисульфатиридина. 4 табл. § (Л