Способ получения гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за средство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида Советский патент 1992 года по МПК C12N15/58 C12N15/70 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения различных видов нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы.

Целью изобретения является получение гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида.

П р и м е р 1 (сравнительный). Изоляция- поли(А)+РНК.

Клетки клеточной линии рака глотки человека Det rolt 5,62 культивируют в модифицированной среды Eagle с 10%-ной сывороткой плода теленка, 0,1 мМ неосновных аминокислот, 1 мМ пиру вата натрия и 0,1% альбумина молочной кислоты на пластиковой чашке в присутствии диоксида углерода при концентрации 5%. Среду отделяют и по 2 мл денатурирующего раствора (6М тиоцианата гуанидина, 5 мМ цитрата натрия, 0,5% саркозина и 0.1М 2-меркаптоэтанола) прибавляют в пластиковую чашку диаметром 9 см для денатурации клеточного материала с целью получения экстракта. Полученный экстракт

4 СА) Ю 00

СА

вносят в раствор 5,7М CsCI и центрифугируют. С 60 чашек выделяют 12 мг РНК. Затем поли (А) РНК очищают с помощью хроматографии на олиго-Т-целлюлозе и получают примерно 600 мкг РНК.

П р и м е р 2 (сравнительный). Получение библиотеки к ДНК.

2 мкг векторного праймера и 3 мкг поли (А)+ РНК смешивают и инкубируют 12 ед. обратной транскрилтазы. Затем встраивают олиго dC, гидролизуют рестриктазой Hind Ml, отжигают и циклизуют. Реакционная смесь, полученная таким способом, хранится как библиотека кДНК при -20°С. Из реакционной смеси получают около 100000 трансформантов, используя фаг х 1776 Е. coli в качестве компетентных клеток.

ПримерЗ (сравнительный). Скрин- нинг.

Для изоляции клонов, которые содержат плазмиду, несущую ген, кодирующий активатор плазминогена-подобный белок ДНК указанных трансформантов гибриди- зуют. В качестве зонда используют фрагменты синтетической ДНК следующей нуклеотидной последовательности:

Зонд I

5 3

AATCGGGCACGATTTCCTG,

Зонд II

5 3

GCCCCCGCACAGGAACCG

Эти последовательности комплементарны относительно частичных последовательностей к ДНК, кодирующей активатор плазминогена меланомы, (Зонд I: количество нуклеотидов 154-173; зонд II: количество нуклеотидов 1099-1116).

Фрагменты мечены 32Р - у - АТФ у 5 -конца. Меченные зонды гибридизируют на фильтре в гибридизационном буферном растворе, состоящем из 900 мМ NaCI, 90 мМ цитрата натрия, Denhart при 45°С в течение 20 ч с трансформантами Е. coli, которые выращены на нитроцеллюлозном фильтре, денатурированы щелочью, Нитроцеллюлоз- ный фильтр промывают в растворе 300 мМ NaCI и 30 мМ цитрата натрия, накрывают рентгеновской пленкой для получения ауторадиограммы, и определяют клоны, положительные к гибридизации. При использовании смеси, состоящей из зондов I и II, из 5000 клонов выделяют 10 клонов, положительных к гибридизации. Среди указанных клонов, положительных к гибридизации, обоими зондами гибридизирова- ны один клон фага х 1776 E.coli (pD/РАЗ). Из указанного клона получают плазмиду рОРАЗ, х 1776 Е. coli (pD/РАЗ). содержащий плазмиду рОРАЗ сдан на хранение в F.R.I. 8

ноября 1984 г. под депозитарным номером FERM-P-7391.

Последовательность кДНК состоит из 2459 пар оснований, кроме поли (А)+-последовательности, находящейся у З -конца. Среди указанных пар оснований, 1548 пар оснований кодируют 516 аминокислот. Эта область кодирования содержит дополнительно последовательность, кодирующую

0 активатор созревшего плазминогена (число нуклеотидов 261-1703). Имеется 5 -некоди- рующая область (нуклеотидное число 1- 155), находящаяся перед кодирующей областью, и З -некодирующая область (нук5 леотидное число 1704-2459), находящаяся за кодирующей областью.

П ример4(сравнительный). Получение мРНК.

20 г клеток почечной ткани, заморожен0 ных при -80°С, размельчают в атмосфере жидкого азота, суспендируют в 80 мл. 5М тиоцината гуанидина, 0,5% N лауроилсар- козина натрия, 25мМ тартрата натрия, 0,1 М меркаптоэтанола и 0,1% антивспени5 вателя (раствор А). Суспензию гомогенизируют и нуклеиновую кислоту отделяют инъекционной иглой типа 20G. 24мл раствора распределяют на 12 мл 5,7 М CsCI, и после центрифугирования выделяют нео0 чищенную РНК.

Всю РНК растворяют в 2%-ном растворе ацетата калия, прибавляют два объема этанола, выдерживают в течение ночи при -20°С и центрифугируют.

5 Поли (А)1 РНК выделяют и очищают хроматографией на колонке с олиго (Ьт.)-целлю- лозой. 10 г тканевых клеток почки дают около 3 мг всей РНК, от 2 до 3% которой представляет собой поли (А)+ РНК.

0 ПримерБ (сравнивательный). Конструирование библиотеки кДНК(1).

Синтез кДНК проводят с использованием 40 мкг поли (А)+РНК, полученной в сравнительном примере 4.

5 При использовании в качестве праймера 40 мкг олиго (дТ) 12-18 для синтеза первой цепи проводят реакцию с 40 ед. обратной транскриптазы в течение 2 ч при 42°С. Матричную РНК удаляют с помощью

0 щелочи и проводят синтез второй цепи со 100 ед, фрагмента Кленова ДНК-полимера- зы 1 E.coli.

После удаления шпилечной петли с помощью S1 нуклеазы цепь (ДП)ю-20 присое5 диняют к З -концу двухцепочечной кДНК с помощью терминальной дезоксинуклеоти- дилтрансферазы и получают около 400 мг дЦ-концевой кДНК.

Эту ДНК сшивают с 800 мг ДНК вектора pBR322 по сайту Pstl. трансформируют в

E.coll XI 776. Таким образом получают библиотеку кДНК(1), состоящую из примерно 2x10 тетрациклинустойчивых и ампицил- линчувствительных трансформантов.

П р и м е р 6 (сравнительный). Получение синтетических олигомеров ДНК для скрининга библиотеки кДНК.

Синтезируют фосфотриэфирным методом следующие 16 различных олигомеров ДНК, состоящих из 14 нуклеотидов, комплементарных иРНК, которая соответствует аминокислотной последовательности человеческой урокиназы (УК)

AACCAAGGTTGATT,

AACCAAGGTTGGTT,

AACCAGGGTTGATT.

AACCACGGTTGATT, AACCACGGTTGGTT,

AACCATGGATTGATT,

AACCATGGTTGGTT.

AACCAAGGCTGATT,

AACCAAGGCTGGTT,

AACCAGGGCTGATT,

AACCAGGGCTGGTT,

AACCAGGGCTGATT,

AACCACGGCTGGTT,

AACCATGGCTGATT,

AACCATGGCTGATT,

AACCAGGCTTGGTT.

Эти 16 олигомеров далее обозначают как УК зонд I.

Для использования в качестве проверочных зондов таким же образом синтезируют следующие 8 различных олигомеров ДНК, состоящих из 14 нуклеотидов, комплементарных к иРНК, которая соответствует Met238, Try, Asn, Asp, Pro287:

5 GGATCATTATACAT 3

GGATCGTTATACAT,

GGATCGTTGTACAT,

GGATCATTGTACAT,

GGGTCATTATACAT,

GGGTCGTTATACAT,

GGGTCGTTGTACAT,

GGGTCATTGTACAT.

Эти 8 олигомеров обозначают как УК зонд II.

Для получения зондов, применяемых для гибридизации колоний, в УК зонды I и II в 5 -конец введена радиоактивная метка.

Пример (сравнительный). Скрининг библиотеки кДНК0).

1. Скрининг.

Автоклавированный нитроцеллюлоз- ный фильтр помещают на LB-агаровую среду, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина, среду инокулируют трансформантами, приготовленными в сравнительном примере 5 так, чтобы обеспечить рост примерно 2000 колоний трансформантов. После 8 ч инкубации при 37°С колонии реплицируют на два нитроцеллюлозных фильтра, которые инкубируют еще 3 ч при 37°С. Исходный нитро- целлюлозный фильтр используют как эталонный, а два вторичных фильтра переносят на LB-агаровую среду, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина и 100 мг/мл хло- рамфеникола, инкубируют в течение ночи при 37°С, затем помещают над 0,5М NaOH

0 и 1,5 м NaCI на 3 мин, чтобы вызвать лизис колоний и денатурацию ДНК, и после нейтрализации над 0,5 М трис-HCI, рН 7,6 и 1,5 М NaCI высушивают на воздухе в течение 2 ч при 80°С.

5 После промывания фильтров в 4xSSC в течение 30 мин при 60 С проводят пре- гибридизацию в 4xSSC, 10 х Denhardt и 50 мкг/мл денатурированной ДНК E.coll, в течение 1 ч при 60°С. После добавления 0,1

0 мМ АТФ и УК зонда I с радиоактивной меткой проводят гибридизацию в течение 16ч при 37°С, промывают 6-8 раз в 4xSSC при 39°С фильтры, сушат на воздухе и подвергают скринингу на трансформанты, гибри5 дизирующиеся с УК зондом I, получают 21 клон-кандидат из 8x10 колоний. Плазмиды этих клонов далее обозначают как плазмиды pKYU1 -PKYU21.

Полученные 21 клон-кандидат обраба0 тывают аналогично описанному и получают клоны, гибридизирующиеся с УК зондом II. Плазмиды в этих клонах далее обозначаются как плазмиды pKYU и 21.

2. Характеристики ДНК плазмиды

5 pKYU21.

После расщепления ДНК плазмиды pKYU21 различными эндонуклеазами ре- стрикации и субклонирования их в М13тр8 проводят определение нуклеотидной после0 довательности. При сопоставлении этой последовательности с хорошо известной аминокислотной последовательностью УК подтверждают, что, хотя кДНК содержит полную область кодирования низкомолеку5 лярной УК, но отсутствует около 100 п.о. ДНК в 5 -конце области кодирования высокомолекулярной УК.

Примере (сравнительный). Конструирование библиотеки кДНК.

0 На основе нуклеотидной последовательности, определенной в п.2 примера 7, синтезируют фосфотриэфирным методом следующий олигомер ДНК:

55 СТСААСАССАТСАСА 3 ,

состоящий из 15 нуклеотидов, комплементарных последовательности иРНК, которая соответствует Ser, Asp, Ala. Leu, Glu .

Используя 100 мкг поли(А)+ РНК в качестве матрицы, синтезируют первую цепь кДНК с помощью 100 ед. обратной транс- криптазы вместе с 1 мкг 5 -32р-меченым праймером с последующим синтезом второй цепи с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы с 1 E.coll. Однонитевую ДНК расщепляют S1 нуклеазой и дЦ-цепь добавляют к З -концу, используя терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу. После совместной ренатурации этой дЦ-хвостовой вставки и дГ-хвостового вектора pBR-322 трансформируют E.coll x 1776, получая библиотеку кДНК(И), состоящую примерно из 5х104 трансформантов.

П р и м е р 9 (сравнительный). Скрининг библиотеки кДНК(Н).

Трансформанты, полученные в примере 8, подвергают гибридизации по методике, описанной в п.1 примера 7. В данном случае в качестве зонда используют фрагмент расщепления 150 п.о. Pst l-Bgl II 5, из pKYU 21 с радиоактивной меткой, введенной методом трансляции. Гибридизацию проводят при 60°С.

Фильтр сушат на воздухе после промывания два или три раза 2xSSC при 60°С и клоны, гибридизирующиеся с указанным зондом, обнаруживают с помощью авторадиографии. Получают восемь положительных клонов. Плазмиды в этих клонах далее обозначают как плазмиды рРЕ1-рРЕ8. При расщеплении ДНК этих плазмид рестрикта- зой Pstl подтверждают, что плазмида рРЕЗ содержит вставку кДНК длиной приблизительно в 420 п.о.

Фрагменты, полученные расщеплением ДНК плазмиды рРЕЗ эндонуклеазной рестрикции Pstl, субкло.нируют в М13 рт8 и проводят определение последовательности оснований. Результаты подтверждают, что кДН К содержит не только кодирующую область достаточной длины на 5 -конце- вой стороне гена проуроклиназы, но также 5 -нетранслируемую область длиной 66 п.о. вверх от кодона инициации трансляции АТС.

Пример 10 (сравнительный). Конструирование гена проурокиназы.

5 мкг ДНК плазмиды pKYU 21, содержащей полную область кодирования уро- киназы, расщепляют эндонуклеазами рестрикции Bgl II и Hind III (no 10 ед.) и выделяют фрагменты ДНК около 5,7 т.п.о. При расщеплении ДНК указанной плазмиды pKYU 21 рестриктазами Bgl II и Nco I (10 ед) получают фрагмент ДНК в 66 п.о. 5 мкг ДНК плазмиды рРЕРЗ, полученной в примере 6, расщепляют 10 ед. рестриктаэ Nco I и Hind III, получая фрагмент ДНК

около 1,1 т.п.о. Эти три различные фрагмента ДНК повторно экстрагируют смесью фенол/хлороформ, осаждают 2 об. этанола для очистки и извлечения ДНК. Эти фрагменты

ДНК сливают вместе с помощью Т4 ДНК- лигазы и трансформируют в E.coll x 1776. Образующиеся трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции, используя процедуру щелочного лизиса, и

0 получают клон, несущий плазмиду pKYU 22, которая содержит полный ген проурокиназы.

ПримерИ (сравнительный). Определение нуклеотидной последовательности

5 сайта вставки плазмиды pKYU 22.

Нуклеотидную последовательность сайта вставки плазмиды pKYU 22 определяют методом МаксамаТилберта и методом обрыва дидезокси-цепи перед субклонирова0 нием в М13тр8.

Вставка состоит из 5 -некодирующего области 66 п.о., главной последовательности ATG(Met)- GGC (Cly), области кодирования проурокиназы AGC (Ser) - СТС (Leu),

5 кодона окончания трансляции ТСА (XXX) и З -нетранслируемого кодона за стоп-кодо- ном.

П р и м е р 12 (сравнительный), Синтез гена проурокиназы, модулированного в

0 5 -концевой области.

Кодоны 5 -терминальной области на- тивной кДНК, кодирующей проурокиназу, замещают так, чтобы обеспечить эффективную экспрессию гена проурокиназы в E.coli

5 saSD последовательностью гена С230, полученного H3 Pceudomonas putide, кодон начала трансляции ATG(Met) встраивают перед кодоном первой аминокислоты (Ser) так, что проурокиназа может прямо экс0 прессироваться; исайтАахИ распознавания энзима рестрикции соединяется с кодирующей областью рядом с SD последовательностью вектора экспрессии. Для этого двунитевой олигомер ДНК синтезируют

5 фосфотриэфирным методом. Эта двухните- вая синтетическая ДНК имеет на одном конце сайт Aat II для введения его в вектор и на другом конце сайт Tag I для присоединения его к гену проурокиназы.

0 Фосфотриэфирным методом синтезируют следующие однонитевые олигомеры ДНК, содержащие соответственно 29,15 и 20 нуклеотидов;

5 CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3 53 TGCAGTACTCGTTGC 5,

3 TCGAGGTCCTCCAAGGCAGC 5 .

1 мкг каждого из синтетических олиго- меров ДНК нагревают в течение 2 мин при 90°С, фосфорилируют на 5 -конце с помощью Т4 полинуклеотидкиназы и очищают. После сушки очищенный материал растворяют в 50 мкл 20 мМ трис-HCI, рН 7,6 и 10 мМ MgCl2, ренатурируют путем нагревания в течение 2 мин при 95°С, охлаждают медленно до комнатной температуры и вы- держивают раствор в течение ночи при 12°С, получая следующую двунитевую ДНК

5 CATGAGCAACGACCTCCACCAGGTTCCGT 3, 3 TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCCAAGGCAGC.

Aatll Sstl Bstl Tag I

5 мкг ДНК плазмиды pKYU22 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Bglll и Aatll, фрагмент ДНК размером 5,7 т.п.о. Другие 5 мкг ДНК той же плазмиды pKYU22 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Pst I и Bgl II и получают фрагмент ДНК около 400 п.о. Этот фрагмент снова расщепляют эндонуклеазой рестрикции Tag I и извлекают фрагмент ДНК размером 260 п.о. Фрагменты ДНК извлекают, очищают экст- ракцией смесью фенол/хлороформ и осаждают 2 об.этанола.

Эти два фрагмента ДНК и указанный двунитевый синтетический олигомер ДНК сшивают вместе с помощью Т4 ДНК-лигазы и продукт сшивания используют для трансформации E.coll x 1776. Трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции по процедуре щелочного лизиро- вания и получают клон E.coll x 1776/pKMUI, несущий плазмиду рКМШ, которая содержит модицифицированный ген про- урокиназы. Клон E.coll x 1776-pKMUI депонирован в F.R.I 11 января 1985 г., как FERM-P-8040.

Пример 13 (сравнительный). Конструирование плазмиды pMuT4L.

Плазмиду экспрессии pMuT4L, содержащую ген проурокиназы человека без точечной мутации, конструируют из указан- ной плазмиды pKMUl и вектора экспрессии pTCMI. E.coll IM103/pTCMI, депонирован с F.R.1.17 августа 1984 г., как PERM P-7779.

5 мкг плазмиды pKMUl из примера 12 расщепляют 10 ед эндонуклеазы рестрик- ции Aatll и дайджест выделяют после обработки фосфатазой кишечника теленка (ФКТ). Другие 5 мкг плазмиды pTCMI расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Aatll и выделяют электроэлюированием фрагмент ДНК размером 500 п.о. Эти два фрагмента ДНК очищают повторной экстракцией смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом.

Оба фрагмента ДНК связывают Т4 ДНК-лигазой и трансформируют в E.coll М103. Трансформанты подвергают скринингу и получают клон, несущий плазмиду рМиТ11, в которой tac промотор {оператор)

и последовательность С230 SD имеют правильную ориентацию по отношению к гену проурокиназы.

Далее 5 мкг плазмиды рКК223-3 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Hind III и дайджест обрабатывают фосфатазой кишечника теленка.

1 мкг плазмиды pMu T1, расщепляют 4 ед. эндонуклеазы рестрикции Dral. Фрагмент расщепления и 1 мкг 5 -фосфорилиро- ванного Hlndlll линкера (дСААССТТС) сшивают с помощью Т4 ДНК-лигазы. Раствор экстрагируют равным объемом смеси фенол/хлороформ и ДНК осаждают добавлением 2 об. этанола. Осадок собирают при 16000 об/мин и 4°С и сушат.

Образующийся фрагмент расщепления рМ и TIL и фрагмент расщепления Hlndlll указанной рКК233-3 сшивают, используя Т4 ДНК-лигазу и трансформируют в E.coll М103. Трансформанты подвергают скринингу и получают клон E.coll M103/pM T21. содержащий плазмиду рНиТ21.

5 мкг плазмиды рМиТ21 расщепляют 10 ед. эндонуклеаз рестрикции Sphl и Tth III и после экстракции смесью фенол/хлороформ ДНК осаждают этанолом. Извлеченную таким образом ДНК снабжают тупым концом при использовании Т4 пол- имеразы в присутствии 0,1 мМ дГТФ, дЦТФ и ТТФ и рециклизируют Т4 ДНК-лигазой. ДНК трансформируют в E.coll I M103 и образуют колонии на LB-агаровой среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Трансформанты подвергают скринингу и получают клон Е. coll IM103/pMuT4.

Пример 14 (сравнительный). Введение специфических мутаций замещения основания в кодон для аминокислоты 157 при использовании фага М13.

1. Получение однонитевой матричной

ДНК.

1 мк каждой из пламиды pKYu 22 и дву- нитевой ДНК фага м13тр8 расщепляют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис- HCI, рН 7,5 7мМ MgCl2, 7мМ /J-меркаптоэ- танола и 50 мМ NaCI, втечение 1 ч при 37°С при использовании 5 ед. Pstl. Соответствующие фрагменты ДНК извлекают после обработки фенолом и осаждения этанолом. Фрагменты ДНК сшивают в 20 мкл раствора, содержащего 66 мМ трис-HCI, рН 7,5, 5 мМ MgCIa, 5 мМ ДТТ и 1 мМ АТФ в течение 16ч при 12°С при использовании Т4 ДНК- лигазы и трансформируют в E.coll IM103, Трансформанты помещают на чашки с мягким агаром, содержащим 0,02% X-gal и 1 мМ IPTG, инкубируют в течение ночи при 37°С. Однонитевую ДНК получают из белых пятен, образованных рекомбинантом.

При использовании некоторых из образующих однонитевых ДНК в качестве матрицы определяют последовательность оснований. Получены цепь кодирования и цепь антйкодмроваиия.

2. Введение специфической мутации замещения основания.

При использовании образующейся ре- комбинантной однонитевой ДНК фага М13 (цепь антикодирования гена УК в качестве матрицы проводят введение сайт-направленной мутации с помощью, олигонуклео- тидного мутагена,

5 GGCCCGCCGATAACATTA 3; .

Хотя этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен к гену УК в одинонитевой матричной ДНК, два основания изменены, при этом кодом ТТТ, который определяют фенилаланин, заменен на кодон CAT, определяющий аспарагиновую кислоту.

При использовании указанного олиго- нуклеотида в качестве праймера синтезируют in vitro двухнйтевую ДНК. При этом 2 ммоль 5 -фосфорилированного праймера добавляют к 0,5 ммоль матричной однонитевой ДНК и смесь инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мм трис-HCi (рН 7,5) 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ NaCI и 7 мМ MgCI в течение 20 мин при 60°С с последующим инкубированием в течение 20 мин при 23°С. К реакционной смеси добавляют по 0,5 мМ дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ до объема 20 мкл и 2 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. Смесь инкубируют в течение 20 мин при 23°С и после добавления 2 мкл 10 мМ АТФ и 1 ед. Т4 ДНК-л-жазы в течение ночи при 12°С. Смесь непосредственно трансформируют в E.coli М103. Получают около 10000 фаговых Пятен на микролитр указанной реакционной смеси.

После переноса образующихся пятен из мягкой агаровой среды на нитроцеллю- лозный фильтр фильтр сушат в вакууме в течение 2 при 80°С, гибридизируют с олиго- нуклеотидным праймером в качестве зонда, меченным 32Р. Фильтр промывают в GxSSC при 52°С и пятна мутантного фага, дающие положительные сигналы, выделяют с помощью авторадиографии. Из мутантного фага получают ДНК мутантного фага двуни- тевого типа (ртЗ). При использовании ДНК мутантного фага в качестве матрицы определяют нуклеотидную последовательность мутантной ДНК и подтверждают появление мутации замещения одиночного основания.

Кроме того, возможно заместить кодом ТТТ, определяющий фенила/тмин и 137 положении, На Gin-определяющий кодон СЛА при использовании следующего олигонук-леотида:

5 GGCCCCGCGAAAACATTA 3 в качестве мутагена.

Пример 15 (сравнительный). Конструирование плазмиды pMu T4L ртЗ,

0 После полного расщепления 10 двухнмтевой ДНК. мутанта М13(ргпЗ) с помощью Pstl выделяют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг плазмиды pMu T41. частично расщепляют Pst и выделяют фраг5 мент длиной около 4,6 т.п.о., из которого удаляют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о.

Каждый из двух указанных фрагментов выделяют обработкой фенолом и осаждением этанолом, осадки смешивают, Смесь

0 лигируют в течение ночи при 12°С Т 4 ДНК- лигазой и трансформируют в E.coli HB101. Трансформанты скринируют и получают клон, содержащий плазмиду pMu T4L ргпЗ E.coli x 1776/pMu T41 ртЗ, несущий плаз5 миду pMu Т41 ргпЗ, депонирован 11 июля 1985 г., с. F.R.I, как FERM-P-8341 и помещен из международное дипонирование 22 января 1986 г,, как PERM BP-971 в соочветствии с положениями Будапештского договора.

0П р и м е р 16 (сравнительный). Конструирование плазмиды pMu T41 pmS.

Получают мутамтный двунитевый фаг M13RFpml, содержащий фрагмет ДНК. в котором кодон ААА для 135-го лизина мутиро5 ван к кодону САА для глютамина, по той же методике, что описана D примере 14, за исключением того, что используют следующий синтетический олигонуклеотид: 5 GATGGACAAAAGCCC. 3

0Затем из фага М13 RF prnl и плазмиды

pMu T41 конструируют PMu T4L prnl no той же методике, что описана в примере 15,

Пример17(сравнительный). Конструирование плазмиды pMu T4L рт4.

.5Мутантный двунитевой фаг, содержащий фрагмент ДНК, в котором кодон ААА для 135-го лизина заменен на кодон глюта- мина, получают по методике, описанной в примере 14, за исключением того, что

0 используют синтетический олигонукпео- тид

5 GATGGACAAAAGCCC 3 Из полученного таким образом мутантного фага получают однонитевый фаг по ме5 тодике, описанной в примере 14. При использовании однонмтевого фага в качестве матрицы кодон ТТТ для 157-го фенилала- нина, затем мутируют к кодону GAT для аспарзгиновой кислоты согласно описанной методике, за искл Очением того, что мспользуют следующий синтетической олиго- нуклеотид:

5 GGCCCCGCGATAAGATTA 3 для получения мутантного двунитевого Фага М13 RFpm4, содержащего фрагмент ДНК. в котором кодом ААА для 135-того лизина заменен на кодон САА для глютамина и кодон для 157-го фенилаланина мутирован на кодон для аспарагиновой кислоты.

Затем из полученного таким образом мутантного фага M13RFpm4 и плазмиды pMu T41L конструируют плазмиду pMu T41L рт4 согласно методике, описанной в примере 15.

Пример 18 (сравнительный). Конструирование плазмиды pMu T91 рт1.

5 мкг плазмиды pMu T41 расщепляют 50 ед. Аса I и 100 ед. Aatll в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 7 мМ MgCJ2, 125 мМ NaCI, 7мМ/ -меркаптоэтано- ла при 37°С в течение 6 ч. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7%- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 5500 п.о. Другие 10 мкг той же плазмиды pMu T4L расщепляют 50 ед. Aatll и 50 ед. Smal. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 2,0%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК 55 п.о. Полученные таким образом два фрагмента ДНК сшивают 5 ед. Т4 ДН К-лигазы. Реакционную смесь используют для трансформации E.coll. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду pMu T8L, и из отобранных колоний выделяют плазмиду pMu T8L

5 мкг таким образом полученной плазмиды PMu T84 расщепляют 50 ед. HindiII. После экстракции фенолом и осаждения этанолом осадок обрабатывают 1 ед. фрагмента Кленова в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCI. рН 7,2, 10 мМ MgCI2, 0,1 мМ ДТТ и 80 мкМ dN IPS при 22°С в течение 30 мин. После экстракции фенолом и осаждения этанолом осадок обрабатывают 5 ед.Т4 ДН К-лигазы в 20 мкл буфера, содержащего 1 мкг линкера pSs T1 и 66 мМ трис-HCI, рН 7,6, 6,6 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ и 1 мМ АТФ при 12°С в течение 2 ч, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осадок расщепляют 50 ед. Pstl в 100 мкл раствора, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5,10 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCI при 37°С в течение 2 ч. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле в извлекают фрагмент ДНК размером 4300 п.о.

5 мкг плазмиды pMu T4L pml расщепляют 50 ед. Pstl. Реакционную смесь затем

подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1200 п.о.

Фрагменты ДНК смешивают и сшивают, используя 5 ед. Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в E.coll IM103. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют на колонии, содержащие плэзмиду pMu T9L pml, и плазмиду рМи

0 Т9 pml выделяют.

П р и м е р 19. Конструирование плазмиды pD PAT2.

50 мкг плазмиды pD РАЗ расщепляют 75 ед. Bgl II в 200 мкл буфера, содержащего

5 10 мМ трис-HCI, рН 7,5,7 MM , 100 мМ NaCI и 7мм /5-меркаптоэтанола при 37°С в течение 4 ч.

После осаждения этанолом осадок инкубируют с 5 ед. фрагмента Кленова в 50 мкл

0 буфера, содержащего 50 мМ трис-HCI, рН 7,2, 10 мМ MgCl2, 0,1 мМ ДТТ и 80 мкМ при 22°С в течение 30 мин. Реакционную смесь подвергают электрофорезу на 0,7%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК

5 размером 1800 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначается как фрагмент ДНК (А).

10 мкг плазмиды pYTU3 расщепляют 20 ед. Sail, осаждают этанолом, обрабатывают 2 ед. фрагмента Кленова. После осаждения

0 этанолом осадок обрабатывают щелочной фосфатазой, фенолом и этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл раствора, содержащего Ю мМ трис-HCI (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА. 5 мкг этой ДНК и 5 мкг фрагмента ДНК(А) обраба5 тывают 10 ед. Т4 ДНК-лигазы. После осаждения этанолом осадок расщепляют 15 ед С1а I. После осаждения этанолом осадок расщепляют 15 ед. BamHI. После осаждения ДНК этанолом осадок обрабатывают 2 ед.

0 фрагмента Кленова. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК размером 2000 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (Б).

5 2 мкг плазмиды рК12 расщепляют 10 ед, Sal I. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 20 ед. фрагмента Кленова, осаждают этанолом, осадок обрабатывают щелочной фосфатазой. После об0 работки фенолом проводят осаждение этанолом. Осадок растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА. 1 мкг этой ДНК и 1 мкг фрагмента ДНК (Б) лигируют. Реакционную

5 смесь используют для трансформации E.coll IM103. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют из колоний, содержащих плазмиду pDPAT2, и выделяют ДНК.

П р и м е р 20. Конструирование плазмиды рНАОО.

5 мкг плазмиды рРЕЗ (такая же какРМУ T4L) расщепляют 10 ед. PVU I. После осаждения этанолом осадок расщепляют 10 ед. EcoR I. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 2000 п.о., который обозначают как фрагмент ДНК (А).

10 мкг плазмиды расщепляют 15 ед. PVUI, а затем 15 ед. BamPI. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2%- ном агарозном геле и извлекают фрагменты ДНК около 2300 п.о. и около 1346 п.о. Фрагмент ДНК около 2300 п.о, обозначают как фрагмент ДНК(Б). 2 мкг фрагмента ДНК 1346 п.о. расщепляют 5 ед. BamHI и подвергают электрофорезу в 1,2%-ном агарозном геле, извлекают фрагмент ДНК около 75 Оп.о., и обозначают как фрагмент ДНК (В).

10 мкг плазмиды pDPAT2, сконструированной в примере 19, расщепляют 15 ед. EcoRI, подвергают электрофорезу в 1,2%- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 472 п.о,, 2 мкл фрагмента расщепляют 1 ед.-Hindlll, подвергают электрофорезу в 5% ПААГ и извлекают фрагмент ДНК около 180 п.о. 1 мкг этого фрагмента и 1 мкг фрагмента ДНК(В) лигируют и с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле извлекают фрагмент ДНК около 931 п.о. 1 мкг этого фрагмента ДНК, 1 мкг фрагмента ДНК(А) и 1 мкг фрагмента ДНК(Б) сшивают2 ед. Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в E.coll IM103. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рНАОО, плазмиду выделяют.

П р и м е р 21. Конструирование плазмиды рНАОЗ.

Плазмиду рНАОЗ конструируют по методике, описанной в примере 20, за исключением того, что вместо плазмиды рРЕЗ используют плазмиду рРЕЗ ртЗ (такая же как pMu T4Lpm3).

П р и м е р 22. Конструирование плазмиды рНА20.

5 мкг плазмиды рНАОО, гидролизуют ре- стриктазой Pstl, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед. Seal с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (А).

5 мкг плазмиды рНАОО расщепляют 7 ед. pstl, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед. EcoRI, осаждают этанолом, осадок подвергают электрофорезу в 0,7%- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 3500 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК(Б).

15 мкг плазмиды pDPAT2, сконструированной в примере 19, расщепляют 20 ед. Bgl II. После осаждения этанолом осадок расщепляют 25 ед.Зса), подвергают электрофорезу в 1,2 %-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 625 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК(В).

10 мкг плазмиды pDPAT2 расщепляют 15 ед Bglll, после осаждения этанолом оса0 док расщепляют 10 ед EcoRI. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 5% ПААГ и извлекают фрагмент ДН К около 150 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (Г).

5 1 мкг фрагмента ДНК(А), 1 мкг фрагмента ДНК(Б), 1 мкг фрагмента ДНК(В) и 1 мкг фрагмента ДНК(Г) сшивают с помощью 4 ед. Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь используют для трансформации E.coll IM103,

0 Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, со- , держащие плазмиду рНА20. Плазмиду выделяют.

П р и м е р 23. Конструирование плазми5 ды рНА23.

Плазмиду рНА23 конструируют по методике, описанной в примере 22, за исключением того, что используют плазмиду рНАОЗ, сконструированную в примере 21, вместо

0 плазмиды рНАОО, использованной для конструирования плазмиды рНА20.

П р и м е р 24. Конструирование плазмиды рНА13.

25 мкг плазмиды рНА23 расщепляют

5 30 ед. Bgl II. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 4 ед. фрагмента Кле- нова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом. Осадок расщепляют 30 ед. Pst с помощью электрофореза в 0,7%-ном ага0 розном геле и извлекают фрагмент ДН К около 3500 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(А), и фрагмент ДНК около 1700 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(Б).

7 мкг фрагмента ДНК(Б) расщепляют 10

5 ед. RSal. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2 %-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(В), и фрагмент ДНКоколо626 п.о., обозначенный

0 как фрагмент ДНК(Г).

2 мкг фрагмента ДНК(Г) расщепляют 5 ед Ddel в 20 мкл буфера, содержащего 100 мм трис-HCl (рН 7,5), 5 мм MgCk, 100 мМ NaCI и 7 мМ /3-меркаптозтанола при 37°С в

5 течение 8 ч. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 1 ед,фрагмента Кле- нова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом. С помощью электрофореза в 5%- ном полиакриламидном геле извлекают фрагмент ДНК размером 241 п.о. 1 мкг этого.

фра мента ДНК 0,5 wr фрагмента ДНК(В) сшиваю с помощью 3 ед, Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь используют для трансформации E.coli IM103. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазми- ду рНА13. Плазмиду выделя.от,

Пример 25. Экспрессия и экстракция продукта гена,

a. E.coli IM103/ pDPAT2, IM103/ РНАОО, ШОЗ/рНАОЗ, IM103/pHA20, 1М103/рНА23 м 1М103/рНА13, полученные в примерах 19- 23, -л E.coli IM 103/pMU T4L, полученную в примере 15, культивируют в 100 мл LB-cpe- ды с добавкой 100 мкг/мл ампициллина при 37°С со вслряхиванием. Когда оптическая плотность при 600 им культуральной среды достигает 0,6 с среде добавляют изопро- пил-Д D-тиогалзктопиранозид до конечной концентрации 1 мМ и культивирование про- должают еще 5 ч Кулыуральный бульон затем переносят в ледяную баню.

Охлажденный бутьон центрифугируют, чтобы собрать клетки, которые затем суспендируют в 50 мл буфера, содержащего 50 мМ трис-HCI (рН 7,5) и 100 мл NaC Клетки собирают центрифугированием, повторно суспендируют в 10 мл того же буфера. После этого клетки разрывают ультразвуком и центрифугируют при 15000 об/мин в тече- ние 10 мин при 4°С

5. Осадки суспендируют в 10 мл буфера, содержащего 7,5 М раствор гуанидингид- рохлорида и 50 мМ трис-HCI, рН 7,5, и отста- ивают при комнатной температуре в течение 90 мин, центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин, и надосадочную жидкость разбавляют до 5 мл раствора, содержащего 1М гуапидингидрохлорида, 0,05 М трис-HCI рН 7,5, 2 мМ глютатиона восстановленного гипа 0,2 мМ глютатиона окисленного гипа, и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор диализуют против 100 об. раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,4 и 0,4 мМ , при 4°С в течение 4 ч, а потом против 100 об раствора, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,4 и 0,1 м NaCI, в течение 2 ч с получением экстракта

П р и м е р 26. Каждый осадок, получен- ный от каждого трансформанта в примере 25 а, в кс/пчестве соответствующем 1 мл купьтурального бульона, пополняют 20 мкл раствора, содержащего 3 М раствор мочевины, 0,08 М раствор дитиотрейтола и 1 % до- децилсульфат натрия. Смесь прогревают при 95°С в течение 5 мин, центрифугируют, надосадочный слой (8 мкл) наслаивают на градиентный гель додецилсульфат натрия - полиакриламид и осуществляют электрофорез После электрофореза гель окрашивают 1 % красителем Coomasie и отмывают. Образец продукта экспрессии из 1М103/рНАОЗ, E.coli, который продуцирует гибридный активатор плазминогена - подобный полипептид НАОЗ 1, сравнивают с образцом продукта экспрессии из IM103/pDPAT2 E.coli, который продуцирует нативный тканевый активатор плазминогена человека (АПТ), м с образцом продукта экспрессии из ШОЗ(рРЕЗ/рМи T4L) E.coll, который продуцирует нативную (УК)человека, при помощи электрофореза.

Каждый образец, полученный описанным путем, подвергают градиентному электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и разделенные протеины переносят на нитро- целлюлозный фильтр, который затем подвергают иммуноанализу Для этого нитроцеллюлозный фильтр пропитывают в растворе 3%-ной желатины в TBS (20 мМ трис-HCI, рН 7,5, и 500 мМ NaCI), после чего фильтр пропитывают в течение 2 ч в растворе, содержащем антисыворотку антитканевого активатора плазминогена, полученную из кролика, иммунизированного тканевым активатором плазминогена. Фильтр промывают раствором TBS и затем пропитывают в растворе, содержащем антикроличье антитело IgG, меченое пероксидазой хре- ча. После тщательной промывки фильтр пропитывают в растворе, содержащем 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 500 мМ NaCI, 0,06% 4-хлор-1-нафтола и 0,015% На02 в течение 5 мин. Результаты показывают, что гибридный полипептид иммунореактивен как к ак- тисыворотке против тканевого активатора плазминогена, так и к антисыворотке против урокиназы.

Пример 27. Получение колонки сефа- розы, родственной фибрину.

3 г фибриногена растворяют в 100 мл связывающего буфера, содержащего 0,1 М NaHCOs, рН 8,3 и 0,5 М NaCI, центрифугируют и надосадочную жидкость используют для последующей реакции.

2 г CNBr-активированной сефарозы 4В (Pharmacia) насыщают 30 мл 1 мМ HCI с получением около 7 мл носителя. Носитель загружают на стеклянный фильтр СЗ и промывают 4 раза 25 мл 1 мМ HCI. Кроме того носитель промывают 20 мл связывающего буфера. Промытый носитель суспендируют з 20 мл того же буфера. Суспензию прибавляют к раствору фибриногена и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч с перемешиванием. Затем надосадочную жидкость удаляют. Остаточный материал пополняют 50 мл 0,2 М раствора глицина

(рН 8,0), перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч с тем, чтобы инакти- вировать остаточные активные группы. После удаления надосадочной жидкости остаточный материал промывают попеременно пять раз 20 мл каждого 0,2 М раствора глицина (рН 8,0} и ацетатного буфера, содержащего 0,1 М ацетат натрия (рН 5,0) и 0,5М NaCl, на стеклянном фильтре с тем, чтобы окончательно получить около 7 мл носителя, связанного с фибриногеном. Этот носитель вносят в колонку диаметром 16 х 70 мм.

300 ед. бычьего тромбина растворяют в 3 мл дистиллированной воды, и раствор постепенно пропускают через колонку, в течение 2 ч для того, чтобы превратить фибриноген, связанный с носителем, в фибрин. Колонку затем уравновешивают 100 мкл буфера, содержащего 0,02 М трис-HCI, рН 7,5, 0,15м NaCl и 0,05% тритон Х-100.

П р и м е р 28. Экстракт, полученный в примере 256, в количестве, соответствующем 5 мкг продукта экспрессии, регулируют до 100 мкл конечного жидкого объема, содержащего 0,02 м трис-HCI, рН 7,5, 0,15 М NaCl и 0,05% тритон Х-100, раствор пропускают через колонку. Колонку промывают 40 мл буфера, содержащего 0,02 М трис-HCI, рН 7,4, 0.15 М NaCl и 0,05% тритон Х-100, элюируют элюирующим буфером, содержащим 2 М KSCN, 0,2 М трис-HCI, рН 7,4 и 0,05% тритон Х-100 с содержанием коллектора фракций. Каждую фракцию измеряют на активность активатора плазминогена при помощи фибринолитической активности на плазминогенсодержащей фибрино- вой чашке.

Фибринолитическую активность измеряют следующим образом. 0,1 г фибриногена типа I растворяют в 5 мл 0,06 М фосфатного буферного раствора и смешивают с 0,025 г агарозы, растворенной в 5 мл того же буфера. К смеси прибавляют бычий тромбин до конечной концентрации 1 мМ, и после перемешивания смесь выливают на чашку Петри диаметром 8,5 см. 10.мкл каждого образца наносят пятнами на фибрино- вую чашку, которую затем инкубируют при 37°С в течение 14 ч, Измеряют диаметры развившихся лизисных кругов. Из измерения коммерческой УК получают градуиро- вочную кривую активности в зависимости от диаметра лизисного круга, на основании которой получают активность испытуемого образца.

Из этих данных видно, что, если коммерческая УК не адсорбируется на фиб- рин-сефарозе, то гибридный полипептид, проявляющий активность активатора плазминогена, который содержит полную или

часть крингл-области, ответственной за сродство к фибрину тканевого активатора плазминогена человека, а также рекомби- нантный тканевый активатор плазминогена,

продуцируемый в E.coll и коммерческий тканевый активатор плазминогена связываются фибрин-сефарозой.

П р и м е р 29. Определение Km с использованием синтетического субстрата S 2288.

S - 2288 растворяют в реакционном буфере, содержащем 0,1М трис-HCI, рН 8,07, 0,01 % тритон Х-100 и 0,5 М NaCl, и получают растворы, содержащие 0,1,0,25, 0,5,0,75

и 1 мМ S-2288.

Экстракты НАОЗ и НА20, полученные в примере 256, и раствор коммерческой УК(по 10 мкл) растворяют реакционным буфером

до конечного объема 400 мкл. К этим образцам прибавляют 2 мкл раствора 1 плазмина и инкубируют при 37°С в течение 1 ч, переносят в ледяную воду, прибавляя к ним 2 мкл раствора 5 мг/мл ингибитора соевого трипсина, чтобы завершить реакцию с плазмином. Пять реакционных смесей получают для каждого испытуемого образца, и к каждой реакционной смеси прибавляют раствор S - 2288 с различными

концентрациями и инкубируют при 37°С в течение 1 ч, переносят в ванну с ледяной водой, прибавляя туда 50 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты. В качестве контроля используют 400 мкл реакционного

буфера вместо 400 мкл испытуемого образца.

Для каждой реакционной смеси измеряют поглощение при 405 нм с вычетом поглощения контрольного образца (величина А).

Скорость реакции составляет V А/60.

Результаты показывают, что гибридный полипептид НАОЗ, состоящий из полипептидной области от 161-го Met до 219-го Gly, соответствующей приблизительно половине крингл-области тканевого активатора плазминогена человека, и полипептидной области от 150-го Gin до 411-го Leu человеческой проурокиназы, где 157-Phe замещен Asp, и данный гибридный полипептид НА20,

состоящий из полипептидной области от первого до 219-го Gly, включающей полную крингл-область тканевого активатора плазминогена человека и полипептидной области от 150-го Gin до 411-го Leu человеческой

проурокиназы, имеют такие же значения Km, что и коммерческая УК.

Это значит, что область, ответственная за ферментативную активность гибридного полипептида, имеет такую же характеристику, что и соответствующая часть нативной

УК, независимо от длины области, ответственной за сродство к фибрину, происходящее от тканевого активатора плазминогена, и независимо от присутствия или отсутствия точковой мутации в области серин-протеа- зы, т.е. у 157-й аминокислоты,

П р и м е р 30. Конструирование плазми- ды pHA21L

10 мкг плазмиды рНА20, построенной в примере 22, гидролизуют 100 ед. Bgl II и 96 ед. Pstl, подвергают электрофорезу в 0,7%- ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 3400 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент (Е).

Кроме того, 4 мкг этой же плазмиды рНА20 переваривают 100 ед, Bgl II и 120 ед. Seal, подвергают электрофорезу в 0,7%- ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 630 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент (F).

5 мкг плазмиды рМ UT9IL pml, полученной в примере 18, переваривают 30 ед. Pstl, подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 1200 п.о. Этот фрагмент ДНК частично переваривают 40 ед. и выделяют фрагмент ДНК около 1100 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент (С).

Синтезируют следующие два олигонук- леотида:

5 ACTGTGATGTGCCCTCCTGCACAGGAA 3, 3 TGACACTACACGGGACCACGTGTCC 5.

1 мкг каждого из этих олигонуклеотидов смешивают в 30 мкл раствора, содержащего 50 мкМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ MgCIa и 10 мМ/ -меркаптоэтанола, нагревают при 70°С в течение 5 мин и затем охлаждают на льду, добавляют 20 ед. Т4 полинуклеотид- ной киназы и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. Реакционную смесь прогревают при 70°С в течение 2 мин и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. После осаждения этанолом осадок смешивают с ДНК-фрагментом (F) и 5 ед. Т4 ДНК- лигазы, инкубируют, экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осадок переваривают 10 ед. FSpl и 20 ед. Bgl II, подвергают электрофорезу в 1,0%-ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК около 650 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК- фрагмент (Н).

Фрагменты ДНК (Е), (G) и (Н) смешивают и лигируют. Реакционной смесью трансформируют IM103 E.cotl. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащей плаз- миду pHA21L Плазмиду pHA21L.выделяют.

П р иМе р31. Конструирование плазмиды pHA24L

5 мкг плазмиды pMUT4pm4 (пример 17) переваривают 50 ед. Pstl, подвергают элек- трофорезу в 0,7%-ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 1200 п.о., который затем частично переваривают 40 ед. FSpl, выделяют фрагмент ДНК около 1100 п.о. и обозначают как ДНК-фрагмент (I).

ДНК-фрагменты (Е) и (G) получают в соответствии с методикой, описанной в примере 29. Эти ДНК-фрагменты (Е), (G) и (I) смешивают и лигируют. Лигазную смесь ис- пользуют для трансформации IM 103 E.coli. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащей плазмиду pHA24L. Плазмиду pHA24L выделяют.

Пример 32. Конструирование плазмиды pHA11L

5 мкг плазмиды рН А21L (пример 29) переваривают 50 ед. Seal и 50 ед. Pstl подвергают электрофорезу в 1,0%-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около 1100 п.о. и обозначают его как ДНК-фрагмент (I).

10 мкг плэзмиды рНА211 переваривают

100 ед., подвергают электрофорезу в

4,0%-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около 330 п.о. и обозначают его

как ДНК-фрагмент (К).

Синтезируют два олигонуклеотида:

5 ATGAAGAGGTGACGTCATGTC 3, 3 TACTTCTCCACTGCAGTACAGACT 5.

2 мкг каждого из олигонуклеотидов смешивают, фосфорилируют 5 -концы и отжигают. После осаждения этанолом отожженных

олигонуклеотидов осадок смешивают с ДНК-фрагментом (К), и сшивают. После осаждения этанолом осадок переваривают 100 ед.Зса и 100 ед. Aatll, выделяют фрагмент ДНК около 250 п.о. Этот фрагмент ДНК

обозначают как ДНК-фрагмент (L).

5 мкг плазмиды pMUTQpml (пример 18) переваривают 50 ед. Aatll и 50 ед. Pstl, подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около

3000 п.о. и обозначают его как ДНК-фрагмент (М), ДНК-фрагменты (I), (L) и (М) смешивают и сшивают. . Реакционной смесью трансформируют IM103 E.coli. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвертают скринингу на колонии, содержащей плазмиду рНА11L Плазмиду рНА11L выделяют в соответствии с традиционной методикой.

П р и м е р 33. Конструирование плазмиды pHA14L

5 мкг плазмиды pHA24L (пример 31) переваривают 50 ед. Sea и 50 ед. Pstl, подвергают электрофорезу в 1,0%-ном агарозном геле и фрагмент ДНК около 1100 п.о. выделяют. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент (N).

ДНК-фрагменты (L) и (М) получают в соответствии с методикой примера 32. Эти фргменты ДНК (L), (M) и (N) смешивают и сшивают Т4 ДНК-лигазой. Лигаз- ной смесью трансформируют IM103 Е.соН. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на содержание плазмиды pHA14L Плазмиду рНА141 выде- ляют.

П р и м е р 34. Конструирование плазмиды pHAOIL.

5 мкг плазмиды РНА21Цпример 30) переваривают 50 ед. EcoR I и 50 ед. Pst I, , подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле, и фрагмент ДНК около 330 п.о, выделяют. Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент (О).

5 мкг плазмиды рНА211 переваривают 50 ед. Seal и 50 ед. Pstl, подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле, фрагмент ДНК около 100 п.о. выделяют и обозначают его как ДНК-фрагмент (Р).

10 мкг этой же плазмиды pHA21L переваривают 50 ед. EcoRI и 50 ед. Seal, подвергают электрофорезу в 2,0%-ном агарозном геле, и фрагмент ДНК около 150 п.о. выделяют и обозначают как ДНК-фрагмент (Q).

Фрагменты ДНК (О), (Р) и (Q) смешивают, сшивают Т4 ДНК-лигазой смесью, трансформируют IM103 Е.соН. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на содержание плазмиды рНА01. Плазмиду рНА01 выделяют.

П р и м е р 35. Конструирование плазмиды pHA04L

Плазмиду рНА041 конструируют в соответствии с методикой примера 34, за исклю- чением того, что плазмиду рНА241, построенную в примере 31, используют вместо плазмиды pHA21L

П р и м е р 36. Экспрессия и экстракция гибридного полипептида HPA24L проявляющего активность активатора плазминоге- на.

Плазмидой pHA24L (пример 31) трансформируют КУ 1436 Е coli, трансформанты культивируют в 5 мл среды L с 50 мкг/мл ампициллина в пробирке при 30°С в течение ночи с перемешиванием 2 мл культураль- ного бульона, инокулируют до 1 л среды L с 50 мкг мл ампициллина в 5-литровой конической колбе, и культивируют при 30°С на воздушной качалке при 260 об/мин, переносят в инкубатор при 37°С и культивируют

5 ч при встряхивании с тем, чтобы экспрес- сировать ген HPA24L гибридного активатор плазминогена - подобного полипептида. Культуральный бульон переносят, центрифугируют. Клетки суспендируют в 1,0 мл буфера, содержащего 0,1 М NaCI и 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, обрабатывают ультразвуком и центрифугируют. Осадок подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в

присутствии додецилсульфата натрия.

Часть нерастворимой фракции суспендируют в 160 мкл раствора, содержащего 6М гуанидингидрохлорид и 25 мМ трис-HCI, рН 8,0, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, доводят до конечной концентрации 50 мМ трис-HCI, рН 8,0 1 М гуанидингидрохлорида, 2 мМ глютатиона восстановленного типа, 0,2 мМ глютатиона окисленного типа , 1 мМ ЭДТА и 0,1%

Твин-80, инкубируют в течение 15 ч при комнатной температуре для получения.неочищенного экстракта.

П р и м е р 37. Определение активности неочищенного экстракта HPA24L с использованием синтетического субстрата S - 2444.

10 мкл сырого экстракта HPA24L прибавляют к буферному раствору, содержащему 0,1 М трис-HCI рН 8,0 и 0,01% тритон

Х-100 до объема 99 мкл. К смеси прибавляют 1 мкл (1 мкг/мл) раствора плазмина, инкубируют при 37°С в течение 15 мин, прибавляют 1 мкл раствора ингибитора соевого трипсина, тщательно перемешивают, прибавляют 0,7 мл буферного раствора, содержащего 2 мМ синтетического субстрата S - 2444 и 0,1 м трис-HCI, рН 8,0 и 0,01 % тритон Х-100, и инкубируют при 37°С в течение 30 мин, после чего прибавляют 100 мкл

ледяной уксуЛюй кислоты.

Измеряют поглощение реакционной смеси при 405 нм. Ферментативную активность в реакционной смеси вычисляют в соответствии с формулой: 1 международная

единица (ME) (OD405/0,395)x6,5, и ферментативной активности образца получается приблизительно 120.

П р и м е р 38. Экспрессия и экстракция других гибридных полипептидов, проявляющих активность активатора плазминогена. Методику, описанную в примерах 36 и 37, повторяют для плазмид pHA21L, pHA11L, pHA14L, pHAOIL и pHA04L, и получают результаты, аналогичные описанным

в примерах 36 и 37.

Формула изобретения Способ получения гибридного активатора плазминогена. содержащего область, ответственную за сродство с

25 173281426

фибрином активатора плазминогена ткани, ирНА21Ц или pHA24L, или рНА11Ц или

область, ответственную за ферментную ак-pHA14L, или pHAOIL. культивировании

тивность проурокиназного полипептида,трансформированных клеток в питательзаключающийся в трансформации клетокной среде при 25-45°С, сборе культивирубактерий Escherlchla coll рекомбинантны-5 емых клеток, их дезинтеграции, отделении

ми плазмидными ДНК рНА20 и рНА13, илиосадка, суспендировании. центрифугироварНА23, или рНАОО, или рНАОЗ, илинии и выделении целевого продукта.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы. Целью изобретения является получение гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида. Способ заключается в том, что путем трансформации клеток бактерий Escherlchia cell рекомбинантными плазмидными ДНК рНАОЗ, или рНА13, или рНА23, или pHA24L, или рНА114, или рНА14Ц или рНАОО, или рНА20, или pHA21L, или pHAOTL, культивирования трансформированных клеток в питательной среде при 25-45°С, сбора клеток и их разрушения выделяют продукт. М и