Способ получения иммобилизованных клеток животного происхождения Советский патент 1991 года по МПК C12N11/00 C12N11/04 

Изобретение относится к биотехно1- логии, в частности к способу инкаш- сулирования живых клеток в полые капсулы с полупроницаемыми оболочка ми, который может найти применение в медицине„

Цель изобретения - упрощение про«- цесса и увеличение стабильности вого продукта за счет повышения ностя оболочек полых капсул.

Способ предусматривает включение клеток животного происхождения во временную матрицу «- гранулы альгина - та кальция, формирование водонераст - воримой оболочки на поверхности временной матрицы с последующим раство - рением временной матрицы и образова - нием полости капсулы., В качестве временной матрицы используют капли водных растворов вязких веществ (вяз-

10

15

20

кость 2 «- 10 сП) и хлорида кальция, которые разбрызгивают в водный вор альгината натрия (), при этом образование полупроницаемой водоне растворимой оболочки капсулы из гината кальция происходит на границе раздела поверхности временной матри - цы и раствора альгината натрия„ После формирования оболочки капсул вязкое вещество временной матрицы диффунди - рует во внекапсульное пространство или, если оно остается внутри капсу - лы, не препятствует размножению ток и диффузии веществ. Для того, чтобы разбрызгиваемые капли при дании в раствор альгината натрия сохраняли сферическую форму в течение времени, необходимого для формировав ния оболочки капсулы9 в изотоничес - кий раствор хлорида кальция с суспендированными в нем клетками добавляют не токсичное для клеток вещество, увеличивающее вязкость растворао Таким образом, разбрызгиваемые капли кого раствора являются временной мат рицей для формирования оболочки кап«- сул В качестве веществ, увеличиваю щнх вязкость разбрызгиваемого раство - ра, можно применять метилцеллюлозу, декстран, агарозу, поливинил пирроли дон, желатин и т с, До

Пример 1. Получение полых капсул для культивирования субстрат независимых клеток

Готовят 50 мл суспензии гибридбм ных клеток в концентрации 2 млн. кл/мл на растворе, содержащем 3% метилцеллю - лозы (5 сП) и 1% хлорида кальция„ Суспензию клеток в указанном растворе .„ из шприца каплями, являющимися временными матрицами, разбрызгивают в сосуд с 0,5 л раствора, содержащего 0,9% хлорида натрия (изотонический раствор)

25

30

35

оболочкой толщиной 70+10 мкм, дйа метр капсул 3+0,5 мм, суммарный объем полости капсул 50 мл„ i Возможно использование водного раствора метилцеллюлозы с концентра цией (2«-10 сП), при использова - кии растворов метилцеллюлозы в предельных значениях концентраций не обеспечивается нужная вязкость

Пример 2 о Получение полых капсул для культивирования поверх - ностно-зависимых клеток

Суспендируют поверхностно«-зависи«- мые животные клетки из расчета 1 млн.кл./мл и микроносители (Цито«- декс« 3 - носитель на основе полиса - харида) из расчета 20 мг/мл в раст воре, имеющем следующий состав: 2% декстрана (МсМ0 100000), 3% желатина (8 сП) и 1,5% хлорида ция, готовят 100 мл суспензии, пензию разбрызгивают из шприца кап«- лями, являющимися временной матрицей в сосуд с 700 мл раствора, содержа - щего 1% альгината натрия и 0,9% хлорида натрия Инкубируют капли временной матрицы в растворе альги ната натрия при комнатной температу - ре и плавном перемешивании в ние 10 мин. После формирования обо«- лочек из альгината кальция на поверх ности временных матриц капсулы пере носят в 0,9%1-ный раствор хлорида нат рия (1,0 л) и инкубируют 10 мин при плавном перемешивании для удаления непрореагировавшего альгината натрия после чего капсулы с заключенными в них поверхностно«-зависимыми клетками и микроносителями переносят в питаг- тельную среду для дальнейшего культи вирования клеток

Получают капсулы с полупроницае - мой оболочкой толщиной 130+30 мкм,

и 4% альгината натрия Инкубируют кап-.5 диаметр капсул 3,5+0,5 мм, суммарный

ли временной матрицы в растворе аль гината натрия при комнатной темпера - туре и плавном перемешивании в тече ние 5 мин После формирования оболо чек из альгината кальция на поверхности временных матриц капсулы перено - сят в 0,9%«-ный раствор хлорида натрия и инкубируют 10 мин при плавном пере«- мешивании для удаления непрореагиро - вавшего альгината натрия, после чего капсулы с заключенными в них клетка - ми переносят в питательную среду для дальнейшего культивирования клеток Получают капсулы с полупроницаемой

50

55

объем полости капсул 100 мл

Возможно использование водного раствора декстрана в интервале концентраций (2НО сП), при исполь зовании раствора декстрана в запре - дельных значениях концентраций не обеспечивается необходимая вязкость суспензиис

Пример 3 Получение полых капсул диаметром 0,5 мм„

Капсулы с заключенными в них клет« ками получают согласно примеру 1, но капли временных матриц разбрыз - гивают с помощью пульверизатора.

5

0

.„

5

30

35

оболочкой толщиной 70+10 мкм, дйа метр капсул 3+0,5 мм, суммарный объем полости капсул 50 мл„ i Возможно использование водного раствора метилцеллюлозы с концентра цией (2«-10 сП), при использова - кии растворов метилцеллюлозы в предельных значениях концентраций не обеспечивается нужная вязкость

Пример 2 о Получение полых капсул для культивирования поверх - ностно-зависимых клеток

Суспендируют поверхностно«-зависи«- мые животные клетки из расчета 1 млн.кл./мл и микроносители (Цито«- декс« 3 - носитель на основе полиса - харида) из расчета 20 мг/мл в раст воре, имеющем следующий состав: 2% декстрана (МсМ0 100000), 3% желатина (8 сП) и 1,5% хлорида ция, готовят 100 мл суспензии, пензию разбрызгивают из шприца кап«- лями, являющимися временной матрицей, в сосуд с 700 мл раствора, содержа - щего 1% альгината натрия и 0,9% хлорида натрия Инкубируют капли временной матрицы в растворе альги ната натрия при комнатной температу - ре и плавном перемешивании в ние 10 мин. После формирования обо«- лочек из альгината кальция на поверх - ности временных матриц капсулы пере носят в 0,9%1-ный раствор хлорида рия (1,0 л) и инкубируют 10 мин при плавном перемешивании для удаления непрореагировавшего альгината натрия, после чего капсулы с заключенными в них поверхностно«-зависимыми клетками и микроносителями переносят в питаг- тельную среду для дальнейшего культиг- вирования клеток

Получают капсулы с полупроницае - мой оболочкой толщиной 130+30 мкм,

диаметр капсул 3,5+0,5 мм, суммарный

объем полости капсул 100 мл

Возможно использование водного раствора декстрана в интервале концентраций (2НО сП), при использовании раствора декстрана в запре - дельных значениях концентраций не обеспечивается необходимая вязкость суспензиис

Пример 3 Получение полых капсул диаметром 0,5 мм„

Капсулы с заключенными в них клет«- ками получают согласно примеру 1, но капли временных матриц разбрыз - гивают с помощью пульверизатора. По лучают капсулы с диаметром 0,5+0,2 мм

Пример 4 о Получение полых капсул с различной (заданной) толщиной оболочки о

Капсулы получают согласно приме 4 ру 1, но время инкубации капель вре«- менных матриц в растворе альгината составляет 1 «- 20 мин о

Зависимость толщины оболочки КЗП сул от времени инкубации: Время инкубации, Толщина оболочки, минмкм

120±6

570+10

10130+10

15190+40

20210+40

При использовании вязких веществ в более высоких концентрациях, т0е0 при вязкости более 10 сП, возникают технологические трудности, так как раствор не проходит через фильеру или его прохождение сильно затруднено Кроме того, увеличивается расход реагентов, не приводящий к улучшению эксплуатационных свойств капсул„ В случае же использования растворов с вязкостью менее 2 сП не образуется временная матрица, необходимая для

формирования мембраны капсулы

При использовании альгината натрия в концентрации менее 1% не происходит образование мембраны капсулы, а при концентрации более 4% в силу высокой вязкости раствора альгината натрия невозможно осуществить равномерное перемешивание суспензии получаемых капсул, что приводит к образованию оболочек капсул неоднородной толщины,,

Пример 5 Получение полых капсул для культивирования поверх ностно-зависимых клетокл

Капсулы получают согласно примеру 2, но в качестве микроносителей ис пользуют Цитолар (на основе жела тины белка)„

Пример 6„ Получение полых капсул для культивирования субстрат«- независимых клеток

Капсулы получают согласно приме- ру 1, но используют 2%с-ный раствор метилцеллюлозы и раствор рида кальция (вязкость раствора 2 сП)

Пример 7 о Получение полых капсул для культивирования субстрат -, независимых клеток,,

Капсулы получают согласно приме - ру 1, но используют раствор

5 0

о

5

0

5

5

метилцеллюлозы и 1%-ный раствор хло«- рида кальция (вязкость раствора 10 сП).

Пример 8 о Получение полых капсул о

Капсулы с заключенными в них клёт«- ками получают согласно примеру 1, но используют клетки линии Nama LVa или RADJI или первично изолированные лейкоциты.

Таким образом, преимущества лагаемого способа заключаются в 6у«- щественном упрощении известного: уменьшается количество стадий за счет самопроизвольного растворения менных матриц и формирования оболо - чек капсул одновременно с растворением временных матриц, уменьшается продолжительность процесса, происхо - дит экономия сырья, так как отпадает необходимость использования альгина«- та натрия для формирования времён - ных матриц и полилизина для формирог- ванил оболочек капсул, кроме того, улучшается качество капсул: их ность выше, чем при получении по вестному способу за счет увеличения толщины от 5НО до 2СК250 мкм

Капсулы прозрачны, что позволяет проводить визуальный контроль куль тур клеток и могут быть использоваг- ны для культивирования клеток разлйч - ного происхождения о

Формула изобретения Способ получения иммобилизованных клеток животного происхождения, включающий получение суспензии ток, образование временных гранул с клетками, последующее формирование на поверхности временных гранул лочек из альгината кальция, получе - ние гранул и растворение временных гранул, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения стабильности целевого дукта за счет повышения прочности оболочек полых капсул, суспензию клеток готовят в изотоническом воре хлорида кальция и вязкого вещест - ва, имеющего вязкость 2-10 сП, затем разбрызгивают суспензию в 1 -4%г-ный раствор альгината натрия,а после формирования на поверхности времен ных гранул оболочек из альгината кальция отделяют полученные капсулы и промывают их раствором хлористого натрия для удаления непрореагировав - шего альгината

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к усовершенствованному способу инкапсулирования живых клеток в полые капсулы с полупроницаемыми оболочками. Цель изобретения - упрощение процесса и увеличение стабильности целевого продукта за счет повышения прочности оболочек полых капсул. Способ заключается в иммобилизации клеток животного происхождения в кольце капсулы прочности путем формирования оболочек капсул толщиной от 20 до 250 мкм из альгината кальция на поверхности самопроизвольно растворяющихся временных матриц. В качестве временных матриц используют капли водных растворов вязких веществ (вязкость 2 - 10 сП), таких как желатин, декстран и др. и изотонического раствора хлорида кальция с суспендированными в них клетками, капли разбрызгивают в водный раствор 1 - 4%-ного альгината натрия. Толщина стенок капсул зависит от времени экспозиции временных матриц в растворе альгината натрия. В случае поверхностно-зависимых клеток в суспензию клеток вводят микроносители, обеспечивающие их рост. 1 табл.