Способ дифференциальной диагностики саркоидоза и ревматизма Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при дифференциальной диагностике саркоидоза и ревматизма, протекающих со сходной клинической картиной.

Дифференциальная диагностика саркоидоза и ревматизма остается до настоящего времени сложной задачей ввиду сходства клинико-рентгенологической картины двух заболеваний (Рабухин А.Е. и др., 1975; А.Г, Хоменко,-0. Швайгер, 1982; В.Н. Адамович и др., 1988). Оба заболевания могут проявляться артралгиями, артритом, узловатой эритемой, плевритом, перикардитом, поражением проводящей системы сердца, лим- фоаденопатией, И саркоидоз, и ревматизм могут протекать с периодами обострения и ремиссии. Морфологической основой как саркоидоза, так и ревматизма является гранулема. Ошибочность диагностики саркоидоза составляет 61-73% ( Филиппов В.П. и др., 1982; В.Н. Адамович, С.Е. Борисов,

1985). Частота поражения легких при ревматизме достигает 44% (ЯсиновскийМ.А. и др., 1969; Саксонов С.И, и др., 1982).

Известен способ диффенциальной диагностики ревматизма путем определения ант.истрептолизина-0 (АСЛ-0 в сыворотке крови (Рабухин А.Е. Избранные труды. М, 1983, с. 73). Однако указанный способ имеет ряд существенных недостатков: накопившийся международный опыт, а также данные отечественных исследователей свидетельствуют о том, что АСЛ-0 23-56% обследованных дает ложноположительные и/или ложноотрицательные и/или ложноот- рицательные результаты, что значительно снижает его диагностическую ценность. Так, АСЛ-0 выявляется в повышенном титре при таких заболеваниях, каканки- лозирующий спондилоартрит, туберкулез и др. По данным ВОЗ, он был выявлен у 20% здоровых школьников вне связи с перенесенной стрептококковой инфекцией и при

xj х|

-ч

О 00

ю

отсутствии каких-либо проявлений ревматизма. В то же время примерно у половины больных ревматизмом титр АСЛ-0 остается нормальным, что не позволяет считать его специфическим адекватным тестом диагностики ревматизма. Возможно, это связано с тем, что АСЛ-0 отражает иммунный ответ организма лишь на внеклеточный ан- тиген стрептококка, не являющийся специфичным для ревматизма. Кроме того, недостатком данною способа дифференциальной диагностики является тот факт, что АСЛ-0 циркулирует в крови в течение сравнительно короткого промежутка времени, что не позволяет использовать его при поздних проявлениях ревматизма, диз( ностика которых особенно сложна в связи с частым субклиническим течением процесса.

А-полисахарид стрептококка, в отличие от АСЛ-0, является группоспецифическим антигеном стрептококка, отражающим иммунный ответ на антиген клеточной стенки стрептококка, что, по данным ВОЗ (1989), имеет непосредственное отношение к патогенезу ревматизма и позволяет рассматривать показатели сенсибилизации к полисахариду как специфические для ревматизма, что подтверждается многочисленными исследованиями.

Преимуществом данного способа является также длительная персистенция антигенов клеточной стенки (А-полисахарид) в крови, что позволяет диагностировать ревматический процесс, развившийся в поздние сроки после перенесенной стрептококковой инфекции, и благодаря этому кардинально улучшить дифференциальную диагностику с саркоидозом.

Комплексное определение А-полисаха- рида и антител к нему, позволяющее выявить различные стороны иммунного ответа на стрептококк, является чрезвычайно важным для своевременной диагностики различных проявлений ревматизма и решает важную задачу дифференциальной диагностики ревматизма и саркоидоза.

Целью изобретения является ранняя диагностика и повышение точности диагностики з&болеваний.

Способ осуществляется следующим образом. Забор крови производится из куби- тальной вены в объеме 5 мл. Далее проводится исследование сыворотки крови методом иммуноферментного анализа.

Подбор оптимальных концентраций сорбируемых антигенов осуществляется в прямой модификации ИФА с использованием иммуноглобулиновых фракций антисы- ворогок к А-полисахариду и клеткам стрептококка группы А типа М 29, меченных

пероксидазой хрена. Для сорбции всех антигенов использовали 96-луиочные полистироловые плашки (Dynatech, Швейцария). Л-полисахарид сорбировали в ФБС в интервале концентраций от 0,1 до 20 мкг/мл в течение 18 ч при 4°С. После окончания сорбции плашки промывали Твин-ФБС и в лунки вносили соответствующие антитела, меченные пероксидазой

хрена, в концентрации 250 нг/мл по перок- сидазе хрена. (После промывки плашек с сорбированными микробными клетками в лунки добавляли 20% нормальную человеческую сыворотку в Твин-ФБС и инкубировали 2 ч при 37°С. Данный этап проводили для блокирования возможно присутствующих на поверхности клеток рецепторов к Fc-фрагменту IgG). Каждую пробу исследовали параллельно в трех лунках. Инкубацию

проводили при 37°С в течение 2 ч. Сыворотки разводили Твин-ФБС. После инкубации и отмывки плашек в лунке вносили по 0,2 мл соответствующих вторичных антител, меченных пероксидазой хрена. Концентрация

вторичных антител, определяемая по пе- роксидазе хрена, составляла 500 нг/мл. Инкубацию проводили при 37°С в течение 2 ч. После инкубации и отмывки в лунки вносили субстрат - 0,35% раствор о-фенилендиамина с 0,006% H2U2 в 0,1 М цитратно-фосфат- ном буфере, рН 5,0. и инкубировали 30 мин при 4°С в темноте. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 0,1 мл А М серной кислоты. Оптическую плотность продукта пероксидазной реакции определяли при длине волны 490 нм на вертикальном абсорбциометре MR или MR-600 (Denatech, Швейцария). Максимальные показатели оптической плотности продукта пероксидазной реакции отмечались при сорбции А-полисахарида - 5 мкг/мл. Эти концентрации указанных антигенов в дальнейшем былииспользованывовсехклинико-иммунологических исследованиях

по определению антител.

Оптимальное фиксированное разведение при определении антител к А-полисахариду - 1:1000.

При определении уровня антител к используемым антигенам все сыворотки от индивидуальных больных в динамике исследовали на одной плашке, одновременно на каждой плашке определяли уровень антител в эталонной сыворотке (эталоном

служил пул 50 донорских сывороток).

Оценку уровня антител, определяемых в ИФА, проводили с использованием двух показателей: абсолютного и относительного. Абсолютный показатель уровня антител

исследуемой сыворотки рассчитывали из отношения оптической плотности продукта пероксидазной реакции исследуемой и эталонной сывороток, взятых в.одинаковом фиксированном разведении. Верхней границей нормального уровня антител считали такой уровень, ниже которого определялись 80-90% абсолютных показателей уровня соответствующих антител контрольной группы здоровых доноров. Относительный показатель уровня антител определяли как процент лиц, у которых абсолютный показатель превышал верхнюю границу нормы.

Для выявления циркулирующих антигенов стрептококка группы А в сандвич-системе ИФА были использованы иммуноглобулиновые фракции кроличьих антисывороток к А-полисахариду стрептококка группы А. Оптимальной концентрацией сорбированных иммуноглобулинов была концентрация 5 мкг/мл.

Оптимальным фиксированным разведением при определении А-полисахарида было выбрано разведение 1:10.

При определении циркулирующих антигенов стрептококка все сыворотки от индивидуальных больных в динамике исследовали на одной плашке, параллельно на каждой плашке определяли уровень соответствующих циркулирующих антигенов в эталонной сыворотке (эталоном служила сыворотка больного ревматизмом с детектируемыми апигенами стрептококка).

Оценку уровня циркулирующих антигенов осуществляли по двум показателям: абсолютному и относительному. Абсолютный показатель уровня антигенов определяли из отношения оптической плотности продукта пероксидазной реакции исследуемой и эталонной сывороток, взятых в одинаковом разведении. Средний абсолютный показатель уровня антигенов рассчитывали как среднеарифметическое абсолютных показателей больных, у которых были выявлены соответствующие циркулирующие антигены. Относительный показатель уровня антигенов определяли как процент лиц, у которых выявлялись соответствующие антигены.

При отсутствии А-полис чхарида в сыворотке крови диагностируют саркоидоз, а при наличии А-полисахарида диагностируют ревматизм.

При титре антител к А-полисахариду, большем, чем 1,4 оптич.ед., диагностируют ревматизм, а при сохранен ш нормы диагностируют саркоидоз.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Больная К., 28 лет (и. б Мг 6021), поступила в клинику с жалобами на

сердцебиение, боли в суставах, субфебриль ную температуру. С 14 лет страдает ревматизмом, митральным пороком сердца. Состояние при поступлении удовлетвори- 5 тельное. В сердце аускультативная картина сочетанного митрального порока, недостаточности аортального клапана. В легких - дыхание с жестким оттенком. Небольшое увеличение подмышечных и передне-шей0 ных лимфоузлов. Рентгенологически: равномерное усиление легочного рисунка. Оба корня умеренно расширены, несколько ан- фильтрированы. В анализе крови СОЭ - 30 мм/ч. Увеличение теней корней легких,

5 увеличение периферических лимфоузлов обусловили необходимость исключения сар- коидоза. Проведено исследование крови по предложенному способу. А-полисахарид - ++4+; антитела к А-полисахариду стрепто0 кокка 3,20 оптич. ед.

Диагностирован ревматизм в активной фазе. Правильность установленного диагноза подтверждена эффективностью антиревматической терапии и дальнейшим

5 динамическим наблюдением за течением заболевания.

Пример 2. Больная М., 47 лет (и.б. Мз 1423), поступила в клинику с жалобами на сухой кашель, субфебрильную температуру,

0 периодические боли в грудной клетке. В детстве перенесла полиаотрит, .расценивэз- шийся как ревматический. В 1988 г, появились боли в грудной клетке, субфеб- рильная температура, сухой кашель. Лече5 ние антибиотиками бзз эффекта. Флюорографически выявлено расширение теней корней легких. При поступлении состояние удовлетворительное. В легких везикулярноедыхание.Короткий

0 систологический шум а верхушке сердца. На

рентгене- и томограммах грудной клетки:

усиление легочного рисунка в прикорневых

отделах билатерально, в основном за счет

сосудистого компонента, увеличение всех

5 групп внутригрудных лимфоузлов. В клинических анализах крови и мочи отклонений от нормы не выявлено. С учетом данных анамнеза проводился дифференциальный диагноз саркоидоза и ревматизма. По

0 предлагаемому способу А-полисахарид стрептококка в сыворотке крови не обнаружен. Антитела к А-полисахариду 1,04 оптич.ед.. Диагностирован саркоидоз 1. Диагноз впоследствии подтвержден морфо5 логически.

Предлагаемым способом обследованы 116 больных, нуждавшихся в проведении дифференциального диагноза между сарко- идозом и ревматизмом. Из них у 53 больных диагностирован саркоидоз, у 63 больных ревматизм. Точность диагностики была подтверждена клинико-морфологическими данными.

А-полисахарид стрептококка был обнаружен описанным выше способом у 92,2% больных ревматизмом, причем у 23,6% - в высоком титре

Присаркоидозе у81,1% больных А-полисахарид не был обнаружен, а в высоком титре он не был обнаружен ни у одного больного саркоидозом.

При сравнении результатов исследования антител к А-полисахариду у больных саркоидозом и ревматизмом получены достоверные различия: 1,94 + 0,17 оптических единиц при ревматизме и 1,03 + 0,03 оптических единиц при саркоидозе (р 0,001).

Предлагаемый способ позволяет провести дифференциальный диагноз саркоидоза и ревматизма с высокой степенью достоверности (95%) без осложнений для больного, помогает правильно назначить лечение основного заболевания, сократить сроки пребывания больного в стационаре до уточнения диагноза на 2 недели, уменьшить общую длительность стационарного лече- ния и улучшить прогноз за счет правильно назначенного лечения.

Формула изобретения Способ дифференциальной диагностики саркоидоза и ревматизма путем иммунологического исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и ранней диагностики, в сыворотке крови с помощью

иммуноферментного анализа определяют наличие А-полисахарида стрептококка и титры антител к А-полисахариду и при наличии А-полисахарида стрептококка и при титре антител к нему выше 1,4 оптических

единиц диагностируют ревматизм, а при сохранении показателей нормы диагностируют саркоидоз.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при дифференциальной диагностике саркоидоза и ревматизма, протекающих со сходной клинической картиной. Цель изобретения -дифференциальная диагностика саркоидоза и ревматизма на ранних этапах и повышение точности диагностики. Способ осуществляется путем определения в сыворотке крови методом иммуноферментнсго анализа титров А-пол- исахарида и антител к А-полисахариду стрептококка. При наличии А-полисахарида и при титрах антител к нему выше 1,4 оптич. ед. диагностируют ревматизм; при отсутствии А-полисахарида и при титре антител к А-полисахариду меньше 1,4 оптич. ед. сар- комдоз Использование способа позволяет повысить эффективность дифференциальной диагностики, сократить время обследования больного на 2 недели, назначить адекватную терапию в более короткие сроки. сл с