Способ лечения кризов отторжения почечного аллотрансплантата Советский патент 1991 года по МПК A61K31/573 A61P37/06 G01N33/50 

сл

с

Изобретение относится к медицине, в частности, к трансплантологии. Цель - повышение обратимости кризов отторжения при уменьшении осложнений гормональной терапии. Для этого перед каждым введением метилпреднизолона определяют NA - K - АТФ - азную активность лимфоцитов, выделенных из крови реципиента, в присутствии метилпреднизолона в различных концентрациях и вводят препарат в минимальной концентрации, рассчитанной с учетом объема циркулирующей плазмы крови, вызывающей максимальное снижение NA - K - АТФ - азной активности лимфоцитов IN VITRO.

Изобретение относится к медицине, в частности к трансплантологии.

Цель изобретения - повышение обратимости кризов отторжения при уменьшении осложнений гормональной терапии

Способ осуществляют следующим образом.

При диагностировании у реципиента криза отторжения почечного трансплантата выделяют из забранной венозной крови реципиента на градиенте плотности фиколл- верографин лимфоциты, концентрацию которых доводят до 2 млн. о 1 мл среде, вводят по 1 мл взвеси лимфоцитов в 6 про- биоок. содержащих в качестве среды инкубации состав, содержащий 100 мМ Nacl 20 мМ KCI. 2,5 мМ MgCl2 0.5 мМ ЭДТА, 5 мМ NaNa, 50 мМ трис-HCI (рН 7,4) и метилпреднизо- лон в концентрациях 0,036: 0,0712: 0,142; 0,214; 0,285; 0,428 мг в 1 мл среды инкубации, одновременно с этим вводят по 1 мл

взвеси лимфоцитов еще в 6 пробирок, содержащих, кроме указанных ингредиентов, 0,5 ммоль уабаина, являющегося специфичным блокатором Na-K-АТФазы.

Инкубируют пробирки при 37°С в течение 15 мин. Затем вносят в пробирки 2,5 ммоль АТФ-МЭ2 и инкубируют при температуре 20°С в течение 20 мин, после чего вносят п пробирки по 1 мл смеси, содержащей 2,5 трис-ацетатного буфера (рН 4,3), содержащего для определения неорганического фосфора 0,2%-ного молибдата аммония и 0, мл 1 %-ного-аскорбата на 5 мМ Си50з и через 20 мин определяют фотокалориметри- чески оптическую плотность проб при длине волны 735 нм.

Рассчитывают содержание неорганического фосфора, образовавшегося при ферментативном распаде АТФ в лимфоцитах по разности оптических плотностей пары пробирок, содержащих, одинаковые концентрао J

СА О СО

ции метилпреднизолона с добавлением и без уабэина, которая характеризует активность Na-К АТФазы инкубируемых лимфоцитов, определяют минимальную концентрацию метилпреднизолона, при ко- торой происходило максимальное снижение выделение неорганического фосфора.

Реципиенту вводят дозу препарата, рассчитанную по произведению оптимальной концентрации препарата In vitro на обь- ем циркулирующей плазмы реципиента (мл).

Повторяют определение эффективной концентрации метилпреднизолона ежедневно перед каждым введением препарата реципиенту.

Эффективную дозу препарата, которую необходимо ввести для лечения отторжения почетного трансплантата, определяют по формуле эффективная доза (мг препарата) оптимальная концентрация in vitro (мг/мл) х ОЦП, где ОЦП - обьем циркулирующей плазмы у данного реципиента (мл), определяемый любым доступным методом.

Таким образом, предлагаемый способ в сравнении с известным позволяет достоверно повысить эффективность лечения кризов отторжения и уменьшить частоту развития основных осложнений, связанных с купированием криза. Кроме того, способ позволяет сократить расход стероидов, в данном случае, метилпреда, используемых для лечения криза.

Пример.В отделении гемодиализа и трансплантации почки выполнена транс- плантация почки больному Б, 40 лет. Диагноз до операции: первично-хронический гломерулонефрит, хроническая почечная недостаточность, терминальная стадия, пролонгированная гемодиализом.

В послеоперационном периоде больной получал профилактическую иммуносуп- оессию метипредом 0,5 мг/кг; азатиприном 1 мг/кг и сандиммуном циклоспорин А) 8 мг/кг. Функция трансплантата после one- рации удовлетворительная.

На 12 сут диагностирован острый криз отторжения. Для лечения криза отторжения был выбран метилпреднизолон. Перед назначением препарата произведен забор крови у больного для определения эффективной дозы препарата. Доза была определена следующим образом: выделили лимфоциты из гепаринизированной (25 ЕД/мл) венозной крови реципиента пу- тем наслоения на градиент плотности (1076-1078) фиколл-верографин.

Полученный пул лимфоцитов дважды отмывали средой 199 и доводили концентрацию клеток до 2 млн с 1 мл.

Лимфоцитарную взвесь в объеме 1 мл вводили в 6 пробирок со средой инкубации, включающей 00 мМ NaCI; 2,5 мМ МдС12; 0,5 мМ ЭДТА; 20 мМ KCI; 5 мМ NaN3; 50 мМ трис-HCI (рН 7,4), и метилпреднизолон в концентрациях 0,036 мг/мл (пробирка 1); 0,0712 мг/мл (пробирка 2); 0,142 мг/мл (пробирка 3); 0,214 мг/мл (пробирка 4); 0,285 мг/мл (пробирка 5); 0,428 мг/мл (пробирка 6).

Одновременно с этим 1 мл лимфоцитар- ной взвеси вводили еще в 6 пробирок (7-12), в которых содержалась аналогичная среда инкубации с такими же концентрациями метилпреднизолона, отличающаяся присутствием 0,5 мМ уабаина, являющегося специфическим блокатором Na-K-АТФазы.

Инкубировали содержимое пробирок в термостате при температуре 37°С в течение 15 мин, после чего в пробирки вводили по 1 мл раствора Na-АТФ (2,5 мМ) и продолжали инкубацию при температуре 20°С в течение 20 мин.

Тормозили реакцию путем введения в каждую пробирку 1 мл смеси, содержащей 0,2%-ного раствора молибдата аммония на ацетатном буфере (рН 4,3) и 0,2 мл 1 %-ного раствора аскорбата на 5 мМ Си04.

Через 20 мин измеряли оптическую плотность содержимого пробирок на фото- электрокалориметре ФЭК-56 М (длина волны 735 нм).

Определяли активность Na-K-АТФазы лимфоцитов (мг фосфора/мл -ч) по разности оптических плотностей (концентрации фосфора, образовавшегося в процессе ферме- тативного гидролиза АТФ) в каждой паре пробирок с одинаковыми концентрациями в них метилпреднизолона с и без уабаина (пробирки 1 и 6, 2 и 8, 3 и 9, 4 и 10, 5 и 11, 6 и 12).

Находили минимальную концентрацию метилпреднизолона, которая приводила к максимальному снижению Na-K-АТФазы лимфоцитов. Оптимальная концентрация метилпреднизолона, при которой наступило максимальное снижение ферментативной активности лимфоцитов реципиента, составляла 0,285 мг/мл.

Рассчитывали эффективную дозу для купирования реакции отторжения аллотранс- плантата в первые сутки развития криза по произведению найденной оптимальной концентрации метилпреднизолона In vitro на обьем циркулирующей плазмы реципиента, который определяли по методу разведения красителя (синий Эванса). Эффективная доза 0,285 х 3250 (мл) 922,5 мг метилпреднизолона.

Вводили реципиенту внутривенно эффективную дозу препарата метипред.

Через сутки повторяли определение Na- К-АТФазной активности лимфоцитов периферической крови для нахождения эффективной дозы препарата. Установили, что минимальная концентрация метилпред- низолона, при которой происходило максимальное снижение ферментативной активности лимфоцитов, составляла in vitro 0.214 мг/мл, объем циркулирующей плазмы 2890 мл. Эффективная доза метипреда 618.5 г. Провели внутривенную инфуэию препарата метипред в данной дозировке.

В течение последующих 2 сут оптимальная концентрация метилпреднизолона In vitro составляла 0,142 мг/мл. Объем циркулирующей плазмы на 3 сут лечения криза отторжения составил 2900 мл, а на 4 сут 2800 мл. Соответственно этим показателям больному был инфузирован метипред в дозе 411.8 и 397, 6мг.

На 5 сут купирования криза оптимальная концентрация метилпреднизолона In vitro составила 0,0712 мг/мл. При объеме циркулирующей п лазмы 2950 мл больному был введен внутривенно метипред в дозе 209, 0 мг.

На 6 сут от начала лечения криза отторжения отмечено восстановление функциональной активности трансплантата. Решено лечение криза метипредом прекратить. Осложнений, связанных с применением стероидов, не регистрировали. Больной был

Осложнения

Известный способ

Сепсис. %

Острые стероидные язвы, в том числе желгкиш. кровотечения, %

Местные гнойные осложнения, %

Пневмония, % Стероидный диабет, %

0

5

0

5

0

5

выписан из отделения через 60 сут после трансплантации с удовлетворительной функцией аллотрансплантата (мочевина крови 8,9 ммоль, креатинин 0,1 ммоль, клубочко- вая фильтрация по клиренсу эндогенного креатинина 30 мл/мин).

Распределение основных осложнений, связанных с применением стероидных препаратов (метипреда) при лечении кризов отторжения в контрольной и опытной группах, представлены в таблице,

Таким образом, предлагаемый способ позволил снизить частоту развития основных осложнений, связанных с купированием кризов отторжения стероидами, в сравнении с известным с 80,7 до 42,1 %.

Формула изобретения

Способ лечения кризов отторжения почечного аллотрансплантата, включающий введение метилпреднизолона. отличающийся тем, что, с целью повышения обратимости кризов отторжения при уменьшении осложнений гормональной терапии, перед каждым введением препарата определяют Na-K-АТФ-азную активность лимфоцитов, выделенных из крови реципиента, в присутствии метилпреднизолона в различных концентрациях и вводят препарат в минимальной концентрации, рассчитанной с учетом объема циркулирующей плазмы крови, вызывающей максимальное снижение Na-K-АТФ-азной активности лимфоцитов.

Предлагаемый способ пт 26

19

7,6

3,9

19,2 7,6 3,8