Способ регенерации растений люцерны Советский патент 1980 года по МПК A01H3/00 

(54).СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ЛЮЦЕРНЫ

1

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве, в частности для соматической гибридизации, в исследованиях по фитопатологии физиологии и генетике растений.

Известны способы получения изолированных протопластов люцерны из мезофилла и.кончиков корней путем воздействия целлюлолитическими и пектолитическими ферментами в растворе осмотиков 1 .

Однако способы регенерации растений люцерны из протопластов неизвестны.

Известны также способы регенерации- растений из изолированных протопластов табака, моркови, картофеля и некоторых других культур 2.

Однако эти способы оказались неприемлемыми для люцерны, что связано со специфическими требованиями данной культуры к питательным средам и условиям инкубации.

Известен также способ регенерещии растений люцерны из каллусов листового происхождения на агаризованных питательных средах 3.

Однако этот способ оказался -псаитлй

из протопластов люцерны, так как каллусы и протопласты имеют cynjeственные различия в отношении питательных сред и условий инкубации, способствующих, образованию регенерантов.

Целью изобретения является получение регенерантов из протопластов для последующей генетической моди10фикации растений.

Поставленная цель достигается тем, что из каллусов листового происхождения выделяют протопласты и инкубируют в жидкой питательной сре15де Гамборга Bj с фитогормонами 1824 ч в темноте, а затем 5-7 недель при освещенности 400-600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмотика до обра20зования многоклеточных колоний, которые переносят на агаризованную питательную среду Гамборга В с фитогормонами, и после образования из них каллусов последние пересажи25вают на среды, способствующие регенерации растений.

Причем в жидкую питательную среду Гамборга БЕ в качестве осмотика вводят 85000-95000 мг/л D-маннита, а в

V Uiar-TRP (ЙИТПГОПМОНОН . 1 . О- 1 . 5 МГ/Л

чп

2,4-D, 0,5-0,75 мг/л кинетика и 0,20,8 мг/л бензиламинопурина, а в агариэованную среду Гамборга Вд в качестве фитогормонов вводят 0,61,0 мг/л бензиламинопурина и 0,30,5 мг/л индолил-3-уксусной кислоты.

Способ осуществляют следующим образом.

Листочки, то есть пластинки тройчатого листа культивируемых сортов и гибридов люцерны стерилизуют в 0,1%-ном водном растворе диоцида и после трехкратной промывки в стерильной дистиллированной воде делают на каждом из них ряд надрезов по всей площади пластинки и помещают на OCHOBHJTO питательную среду Гамборга В ВТ (O.L Gambora et

Ехреrumentall eel 1 ,Research, 50,1, с. 151158, 1968), в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/л бактоагара и 200-300 мг/л нитрата аммония, содержание сахарозы увеличивают до 25000-35000 мг/л и вносят, следующие фитогормоны, мг/л: 2,4-0 дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) 8-16, кинетин 6-10 и «;.-нафтилуксусная кислота (НУК) 0,1-0,5. рН среды доводят до 5,8-6,0.

Состав среды Гамборга Bg (рН 5,5) представлен ниже мг/л:

Макроэлементы

.2500

150

134

250

150

28

37

Микроэлементы

Мп50д-

Нч,-В0о,3

ZnSO, . 7HtiO2

, . ,25

CuSO,. 5H,,025

CoCL , ,,025

КЗ0,75

Витамины

Никотиновая кислота 1 Тиамин HCl10

Пиридоксин HCl1

Миоино ит -100

Сахароза20000

Материал инкубируют 3 неде:ти при непрерывном осве1цении люминесцентными лампами (освещенность 0,54,0 тыс.лк), температуре 26+l c и относительной влажности воздуха 951000% в закрытых прозрачных сосудах

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды, вирусная инфекция устраняется под воздействием фитогормонов.

Развившиеся каллусы переносят в раствор ферментов с осмотиком, содежащий, вес.%: .

Целлюлоза4,0-5,0

Пектиназа2,0-2,5

Хлористый кальций 5,0-5,5 ВодаОстальное

В этом растворе каллусы дсобит д образования однородной суспензии и затем инкубируют в темноте Гц..; температуре в течение 14-16 ч. Выделившиеся протопласты отделяют о грубых примесей путем фильтрования через двухслойную капроновую сетку с диаметром отверстий 125 мкм, а затем отделяют от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (135-160 д), используя для промывки 5,0-5,5%-ный раствор хлористого кальция (CaClg- ) .

После центрифугирования и удаления -супернатанта (недостаточная жидкость) к изолированным протопластам добавляют жидкую среду Гамборга В-, содержание сахарозЕл в которой увеличивают до 25000-35000 мг./л, дополнительно вводят осмоти.к 0-маннит (85000-95000 мг/л) и фитсгормоны, мг/л: 2,4-0 1-1,5, кинетин 0,5-0,75 и бензиламинопурин (БАП) 0,2-0,8 рН среды доводят до 6,0.

Изолированные протопласты инкубируют в закрытых прозрачных сосудах 18-24 ч в темноте, а затем при непрерывном люминесцентном освещении (400-600 лк) при температуре 26 + 1С и относительной влажности воздуха 95-100% и добавляют в течение инкубации (5-7 недель) через каждую неделю 10-15 вес.% свежей питательной среды того же состава, но без D-маннита, 2,4-D и кинетина.

После образования из протопластов клеточных колоний (более 32 клеток в каждой) их переносят на среду Гамборга Bg, в которую вводят бактоагар 8000-10000 мг/л, содержание сахарозы увеличивают до 2500035000 мг/л и.добавляют 0,6-1,0 мг/л БАП и 0,3-0,5 мг/л индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и инкубируют при тех же условиях, но освещенность увеличивают до 3000-4000 лк.

Изолированные протопласты люцорны после вьщелення инкубируют в темноте 18-24 ч, так как на свету большая часть протопластов повреждается. При выдерживании протопластов в темноте больше 24 ч замедляется темп клеточных делений. Образование колоний из протоп.пастов и каллусов из колоний происходит только в условиях оптимальной освещенности Ниже приведены результаты влияния освещенности на образование многоклеточных колоний из протопластов и развитие каллусов из колоний.

Образование колоний и развитие каллусов Не образуются 100-300 Не образуются 400-600 Колонии образуются в течение 5-7 недель, каллусы не образуются 700-1500 Колонии образуютс в течение 5-7 недель, каллусы обр зуются в течение 5-6 недель 2000-2500 .Колонии не образу ются, каллусы обр зуются в течение 4-5 недель 3000-4000 Колонии не образу ются, каллусы обр зуются в течение 2-3 недель 5000-10000 Не образуются Таким образом, оптимальная освещенность при инкубации протопластов до момента образования многоклеточн колоний колеблется в пределах 400.1500 лк, однако с целью экономии электроэнергии используют освещенность 400-600 лк. Быстрое образование каллусов из многоклеточных коло ний (через 2-3 недели) наблюдается при освещенности 3000-4000 лк, умен шение освещенности значительно заме ляет процесс каллусогенеза. Образовавшиеся из клеточных коло ний каллусы переносят на среду того же состава, которая применялась для получения каллусов из листочков и инкубируют в течение 2-3 недель, а затем разросшиеся каллусы переносят на среду Гамборга В, в которую вво дят 6000-8000 мг/л бактоагара, содержание сахарозы увеличивают до 25000-35000 мг/л и добавляют 0,20,8 мг/л БАП. Образовавшиеся на каллусах зеленые эмбриоиды (соматические зародыш переносят на среду того же состава без фитогормонов. Условия инкубации остаются прежними, но длину фотопериода . сокращают до 16 ч в сутки. По мере развития растений на этой среде и появления у- них двух-трёх трой чатых листьев и корней их пересаживают в почву и выращивают в обычных условиях. Пример. Проводилась регенер ция растений из протопластов, вьзделенных из каллусов листового происхождения, гибридной люцерны сортов Рамблер и Зайкевича и желтой сорта .Дединовская. При этом бнзши получены следующие результаты: 90% листочков помещенных на питательную среду с тремя фитогормонами, образовали кал лусы. Последние помещали в раствор ферментов с осмотиком, содержащий вес,%: целлюлоза Onorukap 1500 4,0 пектиназа Serva 2,0, хлористый каль ций (СаС12-6Н50) 5,5 и вода 88,5. Раствор стерилизовали фнльтровпнием через стеклянный фильтр 3G5 (Schott and Сеп, Jena, DOR). По 2 мл раствора заливали в чашки Петри (60к12 мм) и помещали туда по 1 каллусу, затем дробили его шпателем до образования однородной суспензии и инкубировали в течение 14-16 ч в темноте при температуре 26+; 1° С. Выделившиеся протопласты отделяли от грубых примесей путем фильтрования через двухслойную капроновую сетку с диаметром отверстий 125 мкм. Изолированные протопласты отделяли от раствора ферментов четырехкратным центрифугированием (150 д), используя для промывки 5,5%-ный раствор хлористого кальция ( С аС 1 6Н ) , затем добавляли к оставшимся в осадке протопластам жидкую среду Гамборга Вд с о-маннитом и тремя фитогормона ми и высевали в чашки Петри (по 2 мл на чашку Петри 60-12 мл). Финальная концентрация протопластов составляла 40000-60000 в 1 мл. Через 5-6 недель из протопластов образовались клеточные колонии (более 32 клеток в каждой), которые после 2-3 недель инкубации на агаризованной среде Гамборга Bg с 0,8 мг/л БЛП и 0,4 мг/л ИУК образовывали небольшие каллусы (в среднем масса одного каллуса 200 мг). Последние инкубировали 2-3 недели на среде того же состава, которая применялась для получения каллусов из листочков, а затем помещали их на среду с 0,2 мг/л БАП. Через 2-3 недели на каждом каллусе образовалось в среднем 2 зеленых эмбриоида, которые пересаживали на среду Гамборга В без фитогормонов. По мере развития из эмбриоидов растений с двумя-тремя тройчатыми листьями и корнями их пересаживали в почву и выращивали в обычных условиях, где они цвели и образовали семена. Использование изобретения гюзвог.яет ускорить получение новых сортов и гибридов люцерны за счет трансформации (введения молекул ДНК в.протопласты и регенерации измененных растений), соматической гибридизации путем слияния изолированных протопластов и получения высокопродуктивных, устойчивых к неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям межвидовых и межродовых гибридов, трансгеноза - переноса генетической информации в изолированные протопласты с помощью бактерий и вирусов, генетической инженерии и конструирования гибридов, в которых сочетаются органеллы, ядра и цитоплазма, полученные из различных форм растений. Регенерация растений люцерны из протопластов открывает больиие возможности для изучения тонких механиз мов цитодифференцировки/ взаимодействия с патогенами и т.д. Формула изобретения 1, Способ регенерации растений люцерны, включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде и последующее культивирование их в условиях, способствующих образованию из них растений, отличающийся тем, что, с цбшью получения регенерантов из протоплас тов для последующей генетической мо дификации растений, из каллусов лис тового происхождения выделяют прото пласты и инкубируют в жидкой питательной среде Гамборга Вд с фитогор монами 18-24 ч в темноте, а затем 5-7 недель при освещенности 400600 лк с еженедельным добавлением свежей питательной среды без осмоти ка до образования многоклеточных колоний, которые переносят на агари зованную питательную среду Гамборга Вд с фитогормонами, и после образования из них каллусов последние пересаживают на среды, способствующие регенерации растений. 2.Способ по и.1, отличающийся тем, что в жидкую питательную среду Гамборга Bg в качестве осмотика вводят 85000-95000 мг/л D-маннита, а в качестве фитогормонов 1,0-1,5 мг/л 2,4-0, 0,5-0,75 мг/л кинетина и 0,2-0,8 мг/л бензиламинопурина. 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что в агаризованную среду Гамборга В в качестве фитогормонов вводят 0,6-1,0 мг/л бензиламинопурина и 0,3-0,5 мг/л индолил-3-уксусной кислоты. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Селекция и семеноводство, 1977, № 1, с. 35--37. 2.3. Takebe, Т. Hagata. Protoplastes et fusion de cellules somatiques vejetales, № 212, p. 175-188, Paris, 1973. 3.Авторское свидетельство СССР № 679190, кл. А 01 Н 3/00, 1977 (прототип) .