Способ получения промотора для конструирования вектора и способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках Советский патент 1993 года по МПК C12N15/70 C12N15/72 

Изобретение относится к новым векторам экспрессии, несущим новый тип про- мотров, которые конструируются из Ра-промотора оперона рибосомальной РНК (rrn В-оперона) Escherichia coll и нескольких регуляторных последовательностей из 1ас- оперона Е, coll. Кроме того, настоящее изобретение относится к методу конструирования вышеупомянутых новых промоторов и новых векторов зкспресии.

Гены любого происхождения, несущие любой тип информации, могут быть введены в бактериальные клетки путем ДНК-рекомбинации in vitro, т.е. методом хорошо известным специалистам. Устойчивое сохранение чужой ДНК и экспрессия информации, которую она кодирует, могут быть осуществлены при помощи подходящих молекул носителя, т.е. векторов экспрессии. При экспрессии гена, кодирующего белок, в

со ы о

4Ь. Ю

ы

бактериальных клетках ферменты бактерии сначала синтезируют копию мРНК на матрице ДНК в процессе транскрипции, а затем полипептидную цепь с использованием информации, закодированной в НРК-инфор- мации во время процесса трансляции. Инициация транскрипции происходит в области ДНК, называемой промотором. РНК- полимераза узнает эту область и связывается с ней перед началом транскрипции. Методы ДНК-рекомбинации in vitro являются практически экономичными для получения белков, только если эти белки продуцируются в относительно больших количествах, то есть и транскрипций и трансляция являются эффективными. Поэтому очень важно, чтобы промоторы были сильными (кроме других необходимых признаков), то есть, они должны обеспечивать высокий уровень транскрипции.

Путем использования многих видов промоторов, например, lac, trp, bla, lip лямбда Ра-промоторы можно конструировать различные векторы экспрессии. На практике чаще всего используется ас-оперон вследствие его хорошей регуляторной функции, хотя он является относительно слабым промотором. Так называемые гибридные промоторы различного происхождения описаны, например, в Европейской патентной заявке № 82302532 (номер публикации - 0067540). Эти промоторы отличаются тем, что их так называемые -35 и -10 области (которые являются самыми важными областями промотора) являются различного происхождения, то есть, две части промотора различного происхождения соединены вместе в области, находящейся между -35 и -10-областями. Согласно вышеупомянутой патентной заявке, векторы экспрессии, сконструированные с использованием таких гибридных промоторов, являются ценными для промышленных целей, так как их функция является хорошо регулируемой и в то же время обеспечивает возможность эффективной транскрипции 1

Целью настоящего изобретения является построение векторов экспрессии, несущих более сильные промоторы (для получения высокого выхода белка), которые являются в то же время хорошо регулируемыми.

В начале работы над настоящим изобретением заявители использовали векторы экспрессии, описанные -в работе: Lukaesovich et а. Новые регуляторные свойства промоторов гена рРНК Escherichia coif (New regulatory features of the

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

promoters of an Escherichia coll rRNA gene) (J. Bait. 169, 272-277). Лучшими из указанных векторов являются векторы, несущие промоторы со следующими свойствами:

-они сконструированы из части, происходящей от Ра-промотора рибосомального оперона (rrn В) E.coli, и части, происходящей от регуляторных последовательностей lac-оперона Е. coll

-две части, происходящие от rrn В и lac-оперонов соединяются вместе ниже области-10;

-обе области-35 и-10 происходят от rrn В-оперона, в то время, как CG - богатый участок, ниже -10-области в rrn В 2 заменяется аналогичными последовательностями, происходящими из fac-оперона, которые не проявляют репрессорного действия, так, чтобы он не влиял на сильное функционирование других частей промотора.

Хотя эти промоторы конструировались путем комбинации различных частей двух различных промоторов, однако, их нельзя классифицировать как гибридные промоторы, так как наиболее важные для функционирования области, то есть, области -35 и -10 происходят от одного и того же промотора, rrn В PZ- Заявителями было обнаружено, что-эти промоторы обеспечивают очень хорошую экспрессию. При дальшейших исследованиях было обнаружено, что удаление четырех пар оснований: TGCA ниже области -10 в вэкторах, несущих описанные выше промоторы, вдвое повышают интенсивность транскрипции.

Указанное открытие является неожиданным по нескольким причинам. С одной стороны, в специальной литературе нет никаких намеков на то, что вышеупомянутые четыре пары оснований играют какую-либо роль в определении силы промотора, и с другой стороны, удваивание интенсивности транскрипции является весьма значительным результатом в случае промоторов, которые изначально являются очень сильными.

На основании вышесказанного, постоя- щее изобретение относится к промоторам, которые конструируются из Р2-промотора рибосомального оперона rrn В Е. coll и из нескольких регуляторных последовательностей от lac-оперона Е. соН, где указанные две части различного происхождения соединяются вместе ниже области -10 промотора, а последовательность TGCA удаляется непосредственно за областью -10.

Кроме того, настоящее изобретение относится ко всем векторам экспрессии, содержащим вышеупомянутые промоторы; клеткам-хозяевам Е. coli, трансформированным указанными векторами, и способам конструирования указанных промоторов и векторов экспрессии.

Основные признаки векторов экспрессии настоящего изобретения и основные ха- рактеристики генной экспрессии, обуславливаемой указанными векторами, могут быть сформулированы следующим образом:

1.Промотор нового типа (обозначенный: 6/23 -Nslj, который является основным отличительным признаком вышеупомянутых векторов экспрессии, осуществляют инициацию транскрипции с высокой и постоянной интенсивностью независимо от физиологического состояния клетки-хозяина,

-что составляет свыше 90% от всего РНК-синтеза клетки-хозяина, и

-в соответствии с этим, накапливание чужеродного генного продукта составляет вплоть до 30-80% от общего количества клеточного белка.

2.Терминация транскрипции происходит на двойном терминаторном участке, происходящим из rrn В-оперона,

3.Продуктом транскрипции является гибридная молекула мРНК, которая также содержит рРНК-сегмент, происходящий из rrn В-оперона (помимо чужеродной кодирующей области), при этом стабильность переданной информации - выше, а полупериод жизни указанной мРНК-моле- кулы - более продолжительный, чем средний полупериод жизни мРНК.

4.Интенсивность транскрипции может регулироваться посредством встраивания lac-операторной области.

5.С помощью нескольких членов указанного семейства новых векторов синтезируют чужеродный генный продукт в виде белка слияния. С одной стороны, это обеспечивает большую стабильность генного продукта и с другой стороны, позволяет обнаружить присутствие генного продукта и легко измерить уровень экспрессии гена с помощью партнера слияния (альфа-пептид бета-галактозидазы). Чужеродный ген может быть также встроен в указанные векторы ниже lac Z не в форме белка слияния. Этот тип конструкции функционирует подобно бактериальному оперону и чужеродный генный продукт синтезируется как отдельный белок. В этом типе конструкции чужеродный ген может также содержать сайт связывания рибосомы Е. coil. У других членов этого семейства векторов чужеродный ген может встраиваться со своим началом, т.е, положением начала трансляции с оптимальным расположением в конструкции в сайте связывания рибосомы. В этом типе конструкции собственный ATG-кодон чужеродного гена обеспечивает правильную инициацию трансляции. Если встроенный чужеродный ген не имеет указанного ATG

кодона в начале, его можно соединить с

5

0

синтетическим Cla l-линкером, имеющим в себе ATG-злемент последовательности. Чужеродные гены, имеющие собственные сайты связывания рибосом могут также встраиваться в указанные векторы с помощью других сайтов распознавания для рестриктирующих эндонуклеаз.

6.При конструировании промоторов нового типа, функционирующих в векторах настоящего изобретения, удаляют расположенную ниже регуляторную область рибосомаяьного промотора. Таким образом, характеристетчес ский контроль рибосома л ьного промотора, которая является весьма восприимчивой к физиологическим условиям, устраняется и указанный промотор может функционировать в высокой степени

Q независимо от физиологических условий.

7.Транскрипция начинается у цитози- нового основания в исходном рибосомаль- ном опероне. Заменив это основание на аденин или гуанин, можно значительно уве5 личить активность транскрипции промотора.

8.Регуляторные области lac-оперона соединяли вместе с указанными промоторами, Такое построение не влияет на максималь0 ную интенсивность при индуцированных условиях, но при этом позволяет регулировать функцию промотора аналогично lac-onepo- ну; а это препятствует слишком высокому постоянному уровню транскрипции и транс5 ляции, который может оказывать неблагоприятное воздействие на метаболизм клетки-хозяина,

9.Предпочтительными векторами экспрессии настоящего изобретения являются

0 описанные ниже векторы, которые отличаются тем, что они имеют: размер 2800-4500 основных пар; ген устойчивости к ампициллину; оптимизированное расстояние между сигналами транскрипции и трансляции; из$ вестную полную ДНК-последовательность; Coi E репликативного типа; число копий 20-30 на клетку (хотя были построены также варианты с высоким числом копий, в соответствии с патентной заявкой Венгрии, опубликованной под номером Т/35280): несколько различных сайтов распознавания рестриктируюгцих эндонуклеаз для встраивания в экспрессируемый чужеродный ген, причем чужеродный ген может быть встроен при всех трех рамках считывания.

Новые векторы экспрессиит описанные в приведенных ниже примерах, содержат следующие сайты распознавания рестрик- тирующих эндонуклеаз: например, Pvu II, Hind Ш, 5, EcoR I, Bam HI, Bgl II, Xba I, Hpa I.

Способ настоящего изобретения для конструирования указанных векторов экспрессии содержит, в основном, следующие стадии (которые ниже описаны более подробно):

1.Клонирование гтп В-оперона Е. coll в векторе рВР322.

2.Стабильное субклонирование промоторов указанного оперона в плазмидах, ударение основной части структурного гена; помещение областей начала транскрипции (промотор) и завершения транскрипции (терминатор) на близком расстоянии друг от друга.

3.Присоединение начальной части lac- оперона к укороченному rrn В-оперону.

А. Конструирование промотора 6/23 с соответствующими областями регулирования. В результате модификации такого промотора получают промотор 6/23 -Nsi

5. Введение различных сайтов рестрикции в соответствующую часть вектора, что дает возможность встраивания чужеродного гена. Разработка других конструкций векторов экпрессии.

Пример. Конструирование нового семейства векторов экспрессии настоящего изобретения.

1. Выделение полной ДНК из Е. coli или трансдукция бактериофаговой ДНК Е. coll, несущей оперон rrn В, которая может служить в качестве исходного материала при выделении рибосомального оперона rrn В из клетки Е. coii. Оперон rrn В выделяли согласно методу Kiss, A et al. (Gene 4, (1978), 137-152), начиная с трансдукции ДНК фага rif d16, или согласно способу Вогое Т. et al., (Nuel-Acld Res. 6, (1979), 1617-1830) с использованием получения хромосомной ДНК. В первой стадии конструирования вектора экспрессии настоящего изобретения Строили плазмиду рВВ9 (MNG 00300), изображенную на Рис. 1, Эта плазмида была построена путем разрезания плазмиды вектора рВР322 (MNC-00298) (Sateliffe, J.C.. Cold Spring Harbor Symp. Quano. Blol 43, (1978), 77-90) в единичном сайте рестрикции Bam HI и легирования с 7,5 KB Bam

Н1-Ват Hl-фрагмента ДНК rlf° 18. Эта 7,5

кв-вставка в полученной рекомбинантной

.плазмиде содержит полный rrn В-оперон,

несколько дополнительных последователь- нитей, происходящих от Е. coll и элемент последовательности длиной приблизительно 400 п.о., происходящей от лямбда-фага. В регуляторной области rrn В-оперона имеются два промотора: Р1 и Р2, расположенные на 180 и 300 п.о., ниже 16S рРНК-гена, соответственно, (Csordas Toth Е. et al. Nuel. Acid. Res. 7, 1979, 1335-1342).

2. Рекомбинантные плазмиды, содержа- щие rrn В-оперон или область его промотора, вследствие. своих сильных рибосомальных промоторов, инициируют крайне высокий уровень транскрипции, что

перегружает механизм транскрипции клетки-хозяина и приводит к нестабильности при хранении плазмиды. Для устранения этого недостатка in vitro делетировали все части рВРЭ-плазмиды, которые не являются

с важными для дальнейших стадий конструирования. В этой стадии сначала расщепляли ДНК рВВЭ Hpal-рестриктирующей эндонук- леазой и обрабатывали полученную линейную молекулу BAL 31-энзонуклеазой в

0 течение разных периодов времени. Фермент постепенно укорачивал оба конца двухнитевых линейных ДНК-молекул. Полученный в результате образец ДНК, содержащий линейные ДНК-молекулы,

5 происходящие от рВВЭ и укороченные до различной протяженности при помощи BAL 31-энзонуклеазы, лигировали с помощью полинуклеотидной лигазы Т4 в реакционной смеси, которая является оптимальной для

0 тупо-конечного лигирования и циркуляриза- ции, и клеткия Е. coli HB101 трансформировали смесью лигирования. Единичные колонии трансформантов выделяли, и из них получали плазмидную ДНК. В выделен5 ных плазмидных препаратах определяли длину делений посредством переваривания рестриктирующей эндонуклеазой и гель- электрофореза. Затем отбирали плазмиды с различными делетированными rrn В-оперо0 нами, в которых синтезированные более короткие РНК-молекулы все ще имеют 5- и З -концы, характерные для зрелых рРНК-мо- лекул, с тем, чтобы получить делетирован- ные rrn В-опероны, еще продуцирующие

рРНК-подобные молекулы, которые участвуют в нормальном катаболическом пути обмена для рРЯК-молекул. Эти плазмиды обозначили рВВ9 Д, а одной из них является рВВ9 Д9 (Рис. 2). На основании анализа

ДНК-последовательности, делетированный rrn В-оперон указанной плазмиды содержит первые 269 п,о. зрелой 16 S рРНК-молекулы и полный ген 5 S рРНК в конце оперона. Нуклеотидная последовательность в окрестности двух конечных точек делеции, расположенных в первой части гена 16 S рРНК и рядом с концом гена 23 S рРНК, соответственно, представлена на Рис. 3.

В следующей стадии создавали дополнительные делеции в плазмиде с целью получения делетированного rrn В-оперона в как можно меньшей плазмиде. Плазмиду рВВ9 9 линеаризовали путем расщепления ее в единичном сайте Sal I рестиктиругощей эн- донуклеазы, который происходит от рВР322-вектора (В rrn В-опероне имеются два Sail-сайта расщепления, но они были делетированы в предыдущей стадии). Затем полученную линейную ДНК-молекулу переваривали BAL 31-энзонуклеазой для получения сокращения приблизительно длиной 1600 п.о.; расстояние между единичным Sal l-сайтом и концом делетированного rrn B- оперона составляет около 800 п.о. в плазмиде рВВ9 Д 9. С целью удлинения полученной делеции в направлении, противоположном rrn В-оперону, и удаления более несущественных частей векторной ДНК, перед циркуляризацией переваривали также укороченные линейные ДНК-молекулы с помощью Pvu И-рестриктирующей энзонук- леазы, Этот фермент, разрезая ДНК, создает тупые концы, так,что оба конца линейных ДНК-молекул, один из которых образован Pvu II, и другой BAL 31-перевариванием, могут быть соединены вместе без дополнительной модификации. ДНК-лигирование, трансформация и выделение колоний путем физического картирования проводили так, как было описано выше. Для дальнейшей работы по конструированию была выбрана плазмида рВВ9 b 28 (Рис. 4), в которой де- леция. осуществленная путем Sal I-BAL31- Pvu И-переваривания, составляла 2174 п.о. Одна конечная точная этой делеции располагается на 510 п.о. ниже конца зрелой 5 S РНК-последовательности, а другой конечной точкой является сайт расщепления Pvu II вектора pBR322, т.е. 2067 п.о. в соответствии с нумерацией pBR322. Нуклеотидная последовательность окрестностей двух конечных точек делеции представлена на Рис. 3.

Была осуществлена также третья деле- ция в целях удаления области, расположенной выше области промотора rrn В-оперона. Для этого плазмиду рВВ9 b 28 переварива5

0

ли EcoRl- и Fspll-рестриктирующими эндо- нуклеазами, обе из которых имели один сайт распознавания, расположенной выше 16 S РНК-гена rrn В-оперона и выделяли вектор и фрагмент, содержащий большую часть делетированного rrn В-оперона. Липкие концы выделенных EcoRl-Fspll-фрэгментов обрабатывали фрагментом Кленова ДНК- полимеразы I и замыкали их путем лигироО вания с помощью полинуклеотидлигазы Т4. При соединении обработанных концов вместе, обе последовательности распознавания RcoRI- и Fspll-рестриктирующих эндонуклеаз реконструировали: GAATTCGA CTTAACGTT

таким образом, полученная плазмида (р 408-5, MNG-00301) может быть линеаризована обоими ферментами (Рис. 5).

В следующей стадии линеаризовали плазмиду р408-5 путем расщепления FspU- ферментом, сайт распознавания которого расположен на 100 п.о. выше Прибнов-бок- са промотораPI и создавали серии делеции, распространяющихся до промотора Ра, с помощью ограниченного BAL 31-перевари- вания (Рис. 5). После лигирования м трансформации определяли конечные точки

Q делеции в выделенной плазмидной ДНК путем рестриктирующего картирования с помощью BSpRI, Mspl и Hhal-рестриктирующих эндонуклеаз и при помощи секвенирования ДНК. В плазмиде р419-10 делеция длиной

5 197 п.о. удаляла промотор Pi и оканчивалась у 100 п.о. выше промотора Ра. Эта делеция также удаляла из векторной ДНК последовательность длиной 100 и.о., находящуюся выше гена устойчивости к ампицилли0 ну. Нуклеотидная последовательность в окрестностях конечных точек делеции показана на Рис. 3.

3. В следующей стадии указанный укороченный оперон rrn В соединяли с началом

5 lac-оперона. Он был выделен во Hind (II- EcoRI-фрагменте из р1.ВиЗ-плазмидной ДНК (Gentz, R., Langer A., Chang A.C.I., Cohen, S.N. ano Bujard, H., Cloning and analysis of strougpromotor in made possible

0 by downstream placement of PNA termination signal Proc. Natl. Acad. Sci USA 78, (1981) 4936-40). Изолированный фрагмент содержит следующие части в направлении от EcoRl к Hind HI : 160 п.о. ДНК неизвестного

5 происхождения и функции, соединенные с частью, происходящей из lac-оперона и расположенной на 4 п.о. выше Прибнов-бокса lac-промотора. Эта последняя часть, происходящая от lac-оперона, содержит часть lacпромотора -10 область, полный оператор, сайт инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы, расположенный возле 5- конца мРНК, ATG-кодон начала транскрипции и область, кодирующую первые 70 аминокислот / -галактозидазы. Этот N-концевой полипептид (обозначенный а- пептидом) не обладает ft -галактозидазной активностью, но он может воспроизводить часть этой активности при взаимодействии с определенным специфическим типом дефективных молекул /3 -галактозидазы { а -акцепторные мутанты), которые сами по себе являются неактивными.

Плазмиду р419-10 расщепляли Stn I-pe- стриктирующей зндонуклеазой между промотором 2 и терминатором Pi и к тупым концам полученных линейных ДНК-молекул присоединяли синтетический;EcoRI-лйнкер. Смесь лигирования: линкер-плазмиды пере- варивли EcoR 1-рестриктирующей зидонук- леазой и снова лигировали в условиях, оптимальных для циркулизации плазмиды. После трансформации выделяли плазмиду , которая отличалась от плазмиды р419-10 только отсутствием сайта расщепления Stn I реотриктирующей эндонуклеа- зой, который был замещен на EeoRI-сайт расщепления путем введения линкера (Рис. 6). Выделенный Hihd (ll-EcoRI-фрагмент плазмиды р а В и 3 лигировали с р808-2- плазмидной ДНК, переваренной Hihd Ш EcoRl и клетки Е. coll трансформировали смесью лигировзния. Колонии трансформантов выращивали на твердой среде, содержащей окрашенный индикатор, и через 24-36 часов наблюдали голубые колонии, цвет которых указывал на низкий уровень а -пептидной экспрессии. Из этих колоний выделяли плазмидную ДНК м физическое картирование показало, что эти колонии содержат плазмиду рВ27-10 (MNG 00307), созданную посредством соответствующего присоединения указанных двух фрагментов (Рис. б).

4. В следующей стадии, создавали деле- ции между промотором Р2 rrn В-оперона и начальной точкой трансляции, в целях повышения эффективности трансляции. Плазмиду линеаризовали путем EcoRf-перевариванил, последовательности разной длины (до 400 п.о.), удаляли путем переваривания BAL 31-экзонуклеазой и полученные укороченные ДНК-молекулы снова замыкали посредством ДНК-лигазы, Трансформанты, показывающие интенсивный синий цвет (интенсивный синтез а- пептида) на индикаторных чашках, были выделены.-

0

5

0

5

В одной из полученных плазмид (PER- VI/23) последовательность 2 п.о. концов, происходящих от rrn В, расположенных ниже -10-области промотора Р2 и регулятор- ные области транскрипции и трансляции, происходящие от lac-оперона (lac-оператор, сайт связывания рибосомы, начальная точка трансляции) соединяли с промотором Ра с тем же расстоянием, как это имело место для lac-промотора в lac-опероне. Эта конструкция обеспечивает оптимальные условия для трансляции и для регулирования трансляции, так же как в lac-опероне. Эта плазми- да не содержит элемент C-G-богатой последовательности длиной приблизительно 25 п.о., расположенный ниже области -10 промотора Ра, и который ингибирует активность промотора в различной степени в за- аисвимости от физиологических условий клетки. Роль этого элемента последовательности в регулировании активности промотора исследовалась в лаборатории (Lukacsovich, Т et al., J. Bact 169, (1987) 272-277).

Сайт инициации транскрипции этого сконструированного промотора (обозначенного: 6/23) расположен в последовательности, происходящей от lac-оперона и, вероятно, является таким же, как и в lac-oneо роне (GGAATT). Конструкция этого промотора, осуществленное с помощью плазмиды pER-VI/23. обеспечивает экспрессию гена а -пептида на порядок выше, -чем другие похожие конструкции, где различные части,

5 происходящие от rrn В и lac, соединены вместе в других сайтах. Уровень экспрессии гена а-пептида легко измерить спектрофо- тометрическими методами с помощью так называемой реакции «-комплементации

0 (Milter: Experiments In molecular genetics- Cold Spring Harbor, 1972). Еще одним преимуществом конструкции промотора 6/23 является уникальный сайт расщепления Nsi I- рестриктирующей эндонуклеазы, образованный у сайта соединения двух частей различного происхождения, который позволяет упростить дальнейшие альтерации. Одной наиболее ценной из таких альтераций является удаление четырех внутренних нуклео0 гидов сайта расщепления Nsi I (A TGCA Т); что может быть сделано, например, путем обработки ДНК-полимеразой Т4 после расщепления Nsl-эндонуклеазой. ДНК-полиме- раза Т4 переваривает четыре избыточных нуклеотида Nsi 1-расщепленного липкого конца. При лигировании таким образом обработанной при помощи ДНК-лигазы Т4 плазмидной молекулы получали консдрук- цию промотора, в которой -10-область про5

5

мотора Р2 остается интактной, тогда как сайт инициации транскрипции смещается вниз на несколько пар оснований. Вследствие не совсем ясных причин, эта альтерация, кроме того, повышает эффективность транскрипции, не изменяя при этом эффективности трансляции или регуляторных свойств. Эти конструкции плазмиды и промотора обозначали: pER-VI/23 -Nsi и 6/23 -Nsi, Соответственно. На Рис. 7 изображены последовательности промоторов 6/23 и 6/23 -Nsi.

5. Плаэмиды pER-VI/23 -Nsi и pER- VI/23 по большей части отвечают требованиям экспрессии векторов. Однако, их значительным недостатком является ограниченная возможность встраивать чужеродные гены. Это можно сделать лишь при помощи двух уникальных сайтов расщепления рестриктирующих эндонуклеаз: Pvu II и Hind III, расположенных в кодирующей области а -пептида и непосредственно за этой областью, соответственно. С помощью дополнительных преобразований создавали семейство векторов, дающих возможность встраивать чужеродные гены с помощью обычно используемых рестриктирующих эндонуклеаз при всех трех рамках считывания. При конструировании этого семейства векторов, кроме того, руководствовались требованием сделать возможной экспрессию чужеродного гена как отдельного белка, так и белка слияния, который сплавлен со стабильным белком Е. coli. Этот последний вариант необходим, если полупериод жизни чужеродного экспрессируе- мого белка в бактериальной клетке очень короткий, например, человеческого проин- сулина. В этих случаях N-концевая часть белка слияния, которая происходит от Е. coli, может защитить нестабильный чужеродный белок от разложения.

Конструкция семейства векторов, отвечающих вышеуказанным требованиям, была обозначена: pEP-VI/23 (будет описана ниже). После конструирования указанных плазмид типа pER-VI/23, плазмиды типа pER-VI/23 -Nsi строили в соответствии с вышеописанным способом. Во всех случаях при исследованиях было установлено повышение уровня экспрессии гена.

В качестве начальной стадии осузщест- влялось клонирование 109 п.о. Hind IM-Hind fll-полилинкера, происходящего от л VX-ми- ниплазмиды (Т. Maniatls et al. Molecular Cloning A laboratory manual; Cold Spring Harbor. (1982), p. 353 в обоих направлениях к уникальному Hind Ill-сайту расщепления

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

плазмиды pER-VI/23. Помимо двух сайтов расщепления Hind III этот полилинкер содержит Clal, EcoRI, Bam HI, Pst I, Bg ill и Xbal-сайты расщепления для рестриктиру щих эндонуклеаз (см. Рис, 8). Полученные плазмиды, которые содержали полилинкер в направлении, показанном на Рис. 8 и в противоположном направлении, соответственно, обозначили: pER-VI/23 PLH4 и pER- VI/23 PLH5. В этой плазмидной конструкции и ее производных имеется, по меньшей мере, один сайт расщепления для рестриктирующей эндонуклеэзы во всех трех рамках считывания, расположенный в области полилинкерэ, что дает возможность встроить любой чужеродный ген, экспресси- руемый вместе с а-пептидом в виде белка слияния. Специалистам известно, что различные чужеродные гены могут быть слиты с частями / -галэктозидэзы различной длины для обеспечения максимальной защиты. Поэтому, были сконструированы еще два члена указанного семейства векторов. 733 п.о. Pvu Il-Cla (-фрагмента lac Z-гена (ген, кодирующий/5-лагактозидазу в Е. coli) клонировали в Pvu Il-Cla 1-сайтах плазмиды pER-VI/23 PLH4. Этот фрагмент кодировал дополнительные 244 аминокислот / -галак- тозидазы. Полученную плазмиду обозначали: рте а /23.

1621 п.о. Pvu H-EcoRV-фрагмента laz- гена лигировали при тупых концах с 150 по Pvu ll-EcoRI-фрагмента гена, кодирующего хлорамфеникол-ацетил-трансферазу (CAT; происходит от плазмиды рВР329, Gene 17,, (1982) 79-89), соединяя вместе EcoRV и Pvu ll-тупые концы. Полученный Pvu M-EcoRI- фрагмент длиной 1771 п.о, (который является одной длинной открытой рамкой считывания) клонировали в Pvu ll-EcoRf- еайтах плазмиды pER-VI/23 PLH4. Полученную плазмиду обозначили: pL-альфа lnt/23. При этом также были сконструированы мно- гокопийные версии плазмид pER-VI/23 РШ4, pER-VI/23 PLH5 и pL-альфз lnt/23 (см. патентную заявку Венгрии № Т/35280).

При помощи указанных членов семейства векторов, любой чужеродный белок может быть экспрессирован как часть белка слияния, в котором первые 70 (pER-VI/23 PLH4, pER Vi/23 PLH5, первые 280 (рте а /23) или первые 390 (pL-альфа lnt/23) аминокислот происходит от Е. coll (/ -галакто- зидаза, CAT). На Рис. 9 схематически изображены указанные плззмиды.

Вышеупомянутые конструкции векторов также позволяют экспрессировать ин- тактные чужеродные гены в неслитой

форме. Это может иметь место, если встроить чужеродный ген таким образом, чтобы трансляция, начинающаяся на кодирующей области, происходящей от E. coll (lac z или ас z + CAT), останавливалась непосредственно перед стартовым кодоном экспресси- руемого чужеродного гена, и/или если чужеродный геи имеет сильный сайт связывания с рибосомой Е. coll. В этом случае конструкция работает аналогично бактериальному оперону, содержащему два гена. Однако, в системе, содержащей два гена, часто трудно достичь оптимизации экспре- сии гена (результат являлся ненадежным), и поэтому были разработаны новые члены вышеупомянутого семейства векторов, которые, в основном, используются а экспрессии интактных генов. Для достижения этой цели, из плазмиды pEP-VI/23 PLH4 удаляли область, кодирующую а-пеп- 4тид, сохраняя при этим регуляторные после- довательности, и встраивали соответствующий сайт расщепления для ре- стриктирующей эидонуклеазы в плэзмиду с оптимальным расстоянием до iac-регуля- торных последовательностей. В первой стадии указанного конструирования клонировали небольшой Nsi - Afis l-фраг- мент плазмиды pER-VI/23 PLH4 (см. Рис. 7) в уникальные сайты Nsi l-Pvu 11 той же плазмиды. Как показано на Рис. 7, указанный Alu -сайт расположен непосредственно выше стартового кодона трансляции, и очевидно также, что, в то же время,.левая половина этого Alu -сайта расщепления является половиной Pvu И-сайта расщепления. Следовательно, если соединение указанных двух фрагментов было осуществлено правильно, то уникальный Pvu Н-сайт расщепления плазмиды pER-VI/23 PLH4 будет регенерирован. Полученная плазммда была обозначена: pER-VI/23 (ATG); эта конструкция является подходящей для экспрессии чужеродных генов, имеющих .свой собственный стартовый кодок трансляции АТС.

Этот тип чужеродных генов может быть встроен во вновь созданный Pvu ll-сайт расщепления, после затупления концов. Эффективная экспрессия чужеродного гена возможна в том случае, если он имеет не более, чем 8 п.о. (предпочтительно 4 п.о.) выше ATG-кодона. В этом случае расстояние между стартовым кодоном трансляции чужеродного гена и сайтом связывания с рибосомой ас-происхождения является оптимальным или близким к нему.

Кроме того, для облегчения экспрессии синтетических генов осуществляли допол

и

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

нительную модификацию плазмиды pER- VI/23 (-ATG). В указанный уникальный Pvu ll-сайт расщепления встраивали синтетический Clal-линкер (содержащий Clal-сайт расщепления). Фрагмент между вновь созданным Clal-сайтом с Clal-сайтом в области полилинкера плазмиды удаляли. Это было осуществлено путем рециркуляриза- ции большего фрагмента после расщепления плазмиды рестриктирующей эндонуклеазой Cfal, Полученную в результате плазмиду обозначали: pER-VI/23 (+ATG). Эта плазмида является исключительно ценной для экспрессии чужеродного гена, не имеющего стартовый кодон трансляции ATG (в основном для синтетических генов). Любой чужеродный ген, подобный этому, может быть встроен в Clal-сайт указанной плазмиды, после присоединения линкеров Cla к его концам. В этом случае если ориентация вставки была правильной трансляции чужеродного гена будет начинаться в ATG-последовательности Clal-лин- кера. Расстояние между этим ATG-кодоном и lac-происходящим сайтом связывания с рибосомой составляло 8 п.о., что является оптимальной в Е. coll. Указанный вектор, конечно, является весьма ценным для экспрессии чужеродных генов, имеющих свой собственный сайт связывания с рибосомой. Клонирование таких генов легко осуществить при помощи сайтов расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы, расположенных в области полилинкера плазмиды (Clal, EcoRI. BamHI, Pst I. Bg III, Xba I, Hind 111). На Рис. 10 схематически изображены плазмиды. pER-VJ/23 (-ATG) и pER-VI/23 (+ATG).

Как указывалось выше, удаляя внутренние 4 п.о. уникального Nsi (-сайта расщепления из каждой из описанных выше плазмид, можно получить в соответствии с вышеописанной процедурой семейство векторов pER-VI/23 -Nsi.

В нижеследующей части описания настоящего изобретения приводятся примеры использования некоторых членов семейства векторов pER-VI/23 -NslJ.

П р и м е р 2. Осуществление эффективной экспрессии генов при помощи векторов, полученных в настоящем изобретении.

В целях иллюстрации того, что с помощью векторов экспрессии настоящего изобретения можно действительно осуществлять более эффективную экспрессию генов, чем с помощью известных векторов, проводили следующие сравнительны эксперименты.

Плазмидную конструкцию осуществляли с использованием вектора экспрессии рКК223-3, содержащего вышеупомянутый идеальный промотор (tac-промотор) в качестве исходного материала (J, Bronsins; Pharmacia, Molecular Biological № 27-4935- 01), который имеет нуклеотидную последовательность, абсолютно идентичную последовательности плазмиды pER-Vl/23 в области, кодирующей полный «-пептид и в обеих 3 - и 5 -нетранслированных областях. Эти две плазмиды одного и того же репли- кативного типа (Col ), так что, если с их помощью получают разное количество а- пептида или его мРНК, то это возможно лишь при использовании разницы между двумя промоторами, которые они содержат.

Это сравнение не проводили в отношении полупериода жизни мРНК или эффективности трансляции, так как две мРНК, полученные с помощью различных плазмид, являются идентичными.

мРНК, полученная с помощью плазмиды pER-Vl/23 -Nsi является короче на 4 п.о., чем мРНК, полученные при помощи вышеупомянутых двух плазмид. в других отношениях эта плазмида идентична им. При сравнении указанных трех плазмид, в других отношениях эта плазмида идентична им. При сравнении указанных трех плазмид, проведенном путем измерения количеств продуцированных мРНК и а-пептида был установлен тот же порядок; pER-Vl/23 - pER-Vl/23; pKK223-3 производное, где каждый вектор обеспечивает экспрессию в 1,5-2,0 раз выше, чем последующий.

В приведенных ниже примерах описаны испытания векторов экспрессии настоящего изобретения.

П р и м е р 3. Получение белка в Е. coll с помощью новых векторов экспрессии без встраивания чужеродного гена.

Уровень экспрессии а -пептида, полученный без встраивания чужеродного гена (N-терминальная часть fl -галактозидазы в плазмидах pmed VI/23 -Nsi и pL-альфа lnt/23 -Nsi может быть определен не только путем измерения его ферментной активности, но и путем измерения количества полученного белка при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с ДДС-Na. В соответствующих клетках-хозяевах lac Ig, продуцирование а-пептида не может быть обнаружено без индукции. При выращивании бактериальной культуры в YTB-среде при 37°С в фазе логарифмического роста и при индуцировании путем добавления 0,1-5мМ IPTG, экспрессия гена начиналась от промотора 6/23 -Nsi и экспрессирован-

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ный белок аккумулировался в бактериальных клетках в количестве до 20-60% от полного клеточного белка.

Пример 4. Для иллюстрации использования семейства новых векторов настоящего изобретения в общих чертах и для экспрессии низко и высокомолекулярного белка экспрессиЛ высокомолекулярного белка обычно является проблематичной в Е. coil проводили следующий эксперимент:

1.Cial-Pstl-фрагмент клонированного ас-оперона Е. coli встраивали в Clai-Pstl- сайт плазмиды PL-альфа lnt/23 -Nsi (применяя частичное Pst l-переваривание, расщепляли только один Pst l-сайт). Таким образом, была встроена полная кодирующая последовательность гена lac z. Продукт lac z-гена (фермент / -галактозидаза), являются одним из самых крупных белков (мол. масса: 135000). В соответствующем штамме хозяина, после индуцирования с помощью IPTG, можно производить этот фермент в значительной степени (до 15-30% от общего клеточного белка) в ферментко-активной форме,

2.Векторы экспрессии настоящего изобретения могут также действовать как бактериальный оперон, содержащий два гена. Испытания этих функций векторов проводили с использованием двух различных чужеродных генов бактериального происхождения. Первым таким геном являлся вышеупомянутый ген хлорамфеникол- ацетил-трансферазы, который был выделен из плззмиды рВР329.

Tagl-фрагмент. выделенный из рВР329, клонировали в Cta -сайт плазмиды pER- Vl/23 -Nsi PLH4. В этом конструировании САТ-ген экспрессировался из промотора 6/23 -Nsi, с использованием его собственного сайта сеязызания с рибосомой. Процесс транляции проходил на одной длинной мРНК-молекуле, которая является общей для а-пептида и САТ-генов. После проведения электрофореза в ПААГ полного клеточного белка индуцированных клеток было выяснено, что две самые сильные полосы относились к а-пептиду и CAl-белку. Конструкцию плазмиды также модифицировали в плазмиду, экспрессирующую белок слияния. В первой стадии этой модификации удаляли Hind Ill-сайт расщепления, расположенный ниже области полилинкера. Это было осуществлено путем переваривания BAL 31-энзонуклеазой после Xbal-расщеп- ления и затем путем рециркуляризации при помощи лигазы ТА. После чего осуществляли еще одну делецию (после расщепления

плазмиды в оставшемся уникальном Hind ill-сайте) путем ВА1 31-переваривания и ре- циркуляризацми. Полученная плазмида экс- прессировала ген CAT в виде белка слияния и этот белок являлся двухфункциональным ферментом ( а-комплементация/ -галак- торидазы м перенос ацетила на хлодамфе- никол). При подходящих условиях аккумуляция этого белка слияния может достигать до 80% от общего количества кле- точногго белка. Обе вышеописанные плазмиды обеспечивают устойчивость к хло- рамфениколу клеткам хозяина в степени, зависящей от уровня индукции,

3. Другим продуцированным чужеродным геном бактериального происхождения был ген, кодирующий ген метилазы модификации в Bacillus sphaericus (BspPI метилаза модификации), Несмотря, на то, что продукт этого генз сильно влияет на метаболизм клетки Е. coll как ДНК-евязывающий и метилирующий фермент, аккумуляция этого бел- &а может достигать 2-4% от общего количества клеточного белка, если использовать вектор экспрессии настоящего изобретения.

В экспериментах, описанных в примерах настоящего изобретения были использованы следующие материалы и способы:

Химические вещества и другие препараты,

Лабораторные химические вещества, и основном, были куплены у фирм: REAWAL, SIGMA и MERCK.

32-Р-АТРй cz32P-dATP препараты со специфической активностью; TBg/мМ поставлялись из Института Йзото- пов-Венгрии (iZSNTА, Бутапешт).

Реекрмктмрующив эндонуклеазы Ват HI, Hpal, Sal I; Rvu II, EcoRI, Bspl, Hind III, Pst f, BgNI, Xba.l, Fsp IS были получены из Научно-исследовательского биологиче- ыского центра Академии наук Венгрии в соответствии с описанными способами (Методы Энзимрлргии, Ed. Grossmann V. Motdave. vo 6§, pp. 89-180). Рестриктирую- щие эндонуклеазы Cis I, Stu I, Hha t бы/тя получень из Blolab. New England.

Экзонуклеаза BAL 31 v, фермент Клено- ва (ДНК-полимераза I Е. col{- Большой фрагмент) были получены из Биолаб. fvSew England; Бактериальная щелочная фосфота- за (ВАР) из worthingmn: пакреатаз-ПМ-®за и лизозим - от фирмы

Индуцированная полинуклеотидлигаза Т4 была получена в соответствий со способом Murray et al (Murray, N.E., Bruce, S.A, and Murray, KMoIeculareiontngof DIMAIigase

0

5

0

5

0

5 :

.0

5

0

5 i

gene from bacteriophage T4, J. Vol, Blol., 132 (1979)493-505).

Штаммы и плазмиды Escherichla coli HB101 (pro, leu, thl, lac, strp, t, m, endol, rec A: Boyer, H., Roullanod - Dussolx, D.A. complementation analysis of restriction and modification of DMA E, coll, J. Mol, Blol. 41 (1969), 459-472; MNG 00291),

Escherichla coll ED8800 (sup E, sup F, hsd S. met, lac ZM15, rec A 56: Murray, N.E: Brammar. W.J и Murray, K: Lanbold phages that slmpllty recovery of in vitro recomblnates, Mol. Gen. Genet 150 (1977), 53-61; MNG 00291).

rlf°18 (Kirschbaum, 5В и Konrad, E.B. Isolation of specialized lambda transducing bacteriophage, carrying the beta subnlt hene for Escherichia coli ribonuecleic acid polymerase, J. Bacreriol. 1J6,1973,517-526). pBP322(Boliva, F., Rodrignez, R.L, Green P.J., Beltach M,, Heyneker, H.L, Boere. H.M., Crosa, Sand Falkow. S: construction and characterisation of new cloning vehicles Gene 2, (1977), 95-113; MNG 00298).

pLBu 3 (Gentz. R., Chang and analfsis of S.N. and Bujard. H; Cloning and anallsis of strong promoters In made possible by the downstream placement of RNA termination signal Proc. Natl. Acad. Sic. USA 78, (1981) 4936-401).

PHC314 (Boroc, I, Pistal, Gy, and venetlaner P: Ameth od for construction high copy-numbe plasmld vectors 1984, Патентная заявка Венгрии № 3212/83; MNG 00980 E.coli K12) IM107 (Janlsh-Perroh, C. et al. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotlde seguences of the M13 mp 18 and pUC19 vectors, Gene 33, (1985), 103- 119),

Штаммы E, coll выращивали в обогащенных жидких средах, содержащих 10 г Бакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 5 г Na0 на литр. Твердую Среду получали путем добавления 15 гбакто-агара на литр к описанной выше жидкой среде. Йн дикаторные чашки для определения экспрессии а-пептида содержит:

кэзаминокислоты20 г

Na2HPOб г

КНгРОг 3 г

Nff Cf0,5 г

NH4CI1 г

Бакто-агар15 г

Х-да (в растворе диметилфор- мамида)20мг

MgCl22мМ

СаС1г0,1 мМ

НаО1 литр

Штаммы, несущие плэзмиды, содержащие ген, кодирующий ft -лактамазу. выращивали в средах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина.

Выделение плазмидной ДНК осуществляли путем культивирования штамма бактерии, несущего плазмиду. в среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и путем добавления 170 мкг/мл хлорамфеникола к среде при ООбоо нм. 0,7-0,8 к плазмидной ДНК. Выделение плазмиды осуществляли по способу Clewell and Helinski (Clewell, D.В and Helinsll, D.R. Supercoiled circular DNA-protein complex In Escherichia coll purification and induced conversion to an open circularr DNA from Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1969), 1159- 1166). Полученный чистый лизат затем очи- щали при помощи хроматографии .на Сефакриле S1000 (Pharmacia) и путем ультрацентрифугирования в градиенте хлорид цезия/этидиумбромид). Выделение плазмиды аналитического препарата (от 1,0-1,5 мл бактериальной культуры) осуществляли способом Бирнбойма и Доли калийацетатный метод, модифицированным Ish-Horovitr (Maniatis, I., Fritsch, E.F. and Sambrook, 3. Moleculsk cloning Cold Spring Narbor Lab., Нью-Йорк, 1982).

Расщеп ление ДН К-образцов рестрикти- рующими эндонуклеазами осуществляли в соответствии с условиями, установленными Mew England Biolab.

Липкие концы затупляли следующим образом: ДНК осаждали этанолом после расщепления, и снова растворяли до 10-20 мл в буфере, содержащем: 50 мМ Трис-НС (рН 7,4), 7:мМ. Mg.Cli, 1мМ дитиотреитола, 0,1 мМ оАТР, 0,1. мМ dGTP, 0,1 мМ dGTP и 0,1 мМ ТРР (концентрация ДНК составляла 200-250 мг/мл). Указанную реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин при 37°С после добавления 1-2 единиц фрагмента Кленова ДН К-полимеразы 1.

Липкие концы лигировали в реакционной смеси (30-40 мл) содержащей 0,5-1,0 мг ДНК, 66 мМ Трис-НС1(рН 7,6). 5 мМ MgCIa, 5 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТР и 1 ед. индуцированной полинуклеотидлигазы Т4. Смесь лигирования инкубировали в течение 2-3 часов при 14°С (Mariatis, Т., Fritsch, E.F и Sambrook,0:M6lecu}ar cloning. Cold Spring Harbor Lab., Нью-Йорк, 1982). Затупленные фрагменты ДНК лигировали в смеси, содержащей 30-40 мг/мл ДНК, 25 мМ Трис-НС (рН 7,4), 5 мМ MgCl2, 5 мМ дитйотрейтол, 0,25 мМ спермидина, 1 мМ АТР, 10 мг/мл BSA (Сигма, Тип V). После добавления 4-6

5

0 Q 5 0

п. -.: 5

0 ;

ед. индуцированной полинуклеотидлигазы Т4. реакционную смесь инкубировали при 14 °С в течение 8-12 часов.

Электрофорез на агарозном геле (Сигма, Тип I) образцов ДНК проводили в горизонтальной ванне для электрофореза в соответствии с методом HelHng et at. 1974, используя 0,8-2,0% агарозного геля. Электрофорез в полиакриламидном геле ДНК-образцов осуществляли в вертикальной установке, используя 4 и 8% густого геля, толщиной 1 мм, в соответствии с методом Maniatis etal. (Hanlatis. f. Teffey, A. and van de Sande, H: Chain length determination of small double and slnglestranded DNA molecules by polyacrylamlde gel electrophoresis. Biochemistry 14, (1975), 3787-3794).

Выделение ДНК-фрагментов из агарозного полиакриламидного геля осуществляли с использованием диэтиламино этилцеллю- лозы ЕАЕ в соответствии со способом Winberg, С. и Hammarskjold, М., (Isolation, of DNA from agarosegels Application to restriction site mapping of adenovlrus type 16 DNA, Nucf. Acid Res, §, (1980) 253).

Переваривание фрагментов ДНК BAL 31-экзонуклеазой осуществляли в реакционной смеси, содержащей 100 мкг/мл ДНК, 600 мМ MaCI. 12 мМ CaCIa, 20 мМ Трис-HCJ (рН 8.0), 1.0 мМ ЭДТК мМ ЭДТК. при 30°С.

В зависимости от требуемой степени укорочения, в смесь содержащую 1.0 мкг ДНК добавляли 0,4-1,2 ед. фермента. В каждом случае реакцию проводили для каждого ДНК-фрагмента с данным препаратом фермента для практического определения степени укорачивания, при помощи электрофореза образцов после различных периодов инкубирования. Ферментную реакцию прекращали путем экстрагирования реакционной смеси фенолом и после очистки этанолом ДНК-концы затупляли при помощи Кленов-полимеразы при условиях, подходящих для мечения З -концов (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. and Sandbrook J.: Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., Нью-Йорк. 1982).

Компетентные клетки Е. coll получали из штаммов Н8101. С600, IM107 и ED 8800, в соответствии с СаС 2-методом Манделя и Xura (Maniatis, Т., Fritsch, E.F. и Sambrook, J.:Molecula cloning. Cold Spring Harbor Lab.. Нью-Йорк, 1981).

Дефосфорилизация 5 -концов ДНК- фрагментов, мечение концов полинуклеоти- диназой с использованием J- P-ATP, и анализ нуклеотидной последовательности

осуществляли методом Maxam, А и Gilbert, W. (Sequencing end - labelled DNA with basespeciflc Chemical cleavages. Meth. Enzymol 65, (1980) 499-560.

Другие способы, используемые в конструировании векторов настоящего изобретения, описаны в протоколе лабораторного руководства Manlatis, Т., Fritsch, E.F и sambrbok. Я. Molecular cloning, Cold Spring Harbor Lab., Нью-Йорк, 1982).

Описание к рисункам

Рис. 1. Структура плазмида рВВ9

Часть плазмиды рВР322 изображена

двойной линией, а чаксть rif a 18 обозначена жирной линией. Наиболее важные гены и регуляторные области обозначены кружочками. Сайты расщепления для рестрик- тирующей эндонуклеазы показаны стрелками.

ampr ген для /З-галактамазы, сообщающий устойчивость к ампициллину;

tetr ген, кодирующий устойчивость к тетрациклину (так как ДНК-фрагмент вставляли в BanHf-сайт, то ген устойчивости к тетрациклину был инактивирован);

А часть, происходящая от лямбда в фрагменте, полученном из трансдукции фагового rif а18;

5S; 16S; 23S: гены для различных зрелых ДНК-молекул оперона rrn §

Р1; Р2: промоторы оперона гго В

Т1; Т2: терминаторы оперона ггп В

Р: Pst I; Е; EcoR I; H: Hind Л; В; S: Sal I; Hp: Hpa I; Pv: Pvu II; F: Fsptl

Рис. 2. Структура плазмиды рВ89 ill

Заштрихованная часть означает делегированную из плазмиды рВВЭ переваривания ВА131-эндонуклеазо:й. ЙШ- ревиатуры описаны в описании к Рис. 1.

Рис. 3. Нуклеотидная последов&теяь ность в окрестности точек присоедш&иш частей различного происхождения в ййаз- миде pER-V /23.

Рис, 4. Структура плазмиды

Обозначения и аббревиатуры дамйt в описании к Рис. 1 и Рис. 2. Заштрихоеамные площади означают части, делетироваяные из плазмиды рВВ9.

Рис. 5. Структура плазмиды р408-5.

Обозначения даны выше.

Рис. 6. Совместное построение частей оперона rrn В и lac для получения плазмид рЕВ-типа.- .

На рисунке подробно изображено построение плазмид типа pER из плазмиды

Р419-10 и фрагмента В (EcoRl-HInd III

плазмиды pIBu 3.

Аббревиатуры: Ар : ген устойчивости к ампициллину;

R0: происхождение репликации; Ti и Та; терминаторы оперона rrn В; Р2: один из промоторов оперона ггп В; 16S и 5S: оставшиеся части оперона rrn В. Во- | рота обозначают делеции. Верхняя панель

| справа означает семейство плазмид pER, члены которого отличаются друг от друга лишь длиной BAL 31-делеции, (Несколько

ворот вокруг символа А означает делеция | различной длины).

Рис. 7. Нуклеотидная последовательность промоторов плазмид рЕР VI/23 и pER VI/23 -NsiJ

Части присоединения, происходящие от rrn В и fac-оперона, соответственно, (а) в плазмиде pER VI/23 и (b) в плазмиде pERU/23 -Nsl

:

;

Обозначения: АТ-богатая область пропромотора, расположенная выше rrn В Рг

область -35 промотора 6/23, которая является областью, происходящей от rrn В

область -10 промотора 6/23, которая является областью, происходящей от rrn В хх сайт инициации транскрипции v сайт связывания рибосомы, происходящий от lac.

Часть последовательности, написанная прямым шрифтом, является частью, происходящей от оперона rrn В, а другая часть, написанная курсивом, происходит от lac. Ген оперона lac-оперона и первые несколько аминокислот а -пептида обозначены чертой под последовательностью.

Рис. 8. Нуклеотидная последовательность Hind HI - Hind ill полилинк«ра, происходящего от я vx-миниплазмиды в направлении, полученном для плазмид типа PLH4.

Рис. 9 и 10. Схематическое представление семейства новых векторов экспрессии.

На окружности, представляющей плаз- мидную молекулу обозначены: ген устойчивости к ампициллину (ApR), точка инициации репликации (ORI), промотор b/23 -Nsi (p), сайт связывания рибосомы (SO) и две тер- минаторные области (Ti, 12). Часть, обозначенная волнистой линией, означает отличия отдельных членов семейства плазмид. В подробном изображении отдельных частей молекулы встречаются следующие аббревиатуры: а : последовательности, кодирующие различные части / -галактозидазы; CAT: последовательность, кодирующая хло- рамфеникол-ацетил-трансферазу, Показаны такие сайты расщепления для рестриктирующих эндонуклеаз, подходящие для клонирования (Pvu I, Hind III, Cla I, EcoRi, BamHL Pstl, Bg III, Xba I, Hpa I). EcoRV/Pvull означает два сайта рестрикции, которые были построены вместе и не могут быть снова разрезаны ни одним из ферментов.

Депонированные штаммы

Формула изобретения

1. Способ получения промотора для конструирования вектора, предусматриваю- щий лигирование фрагментов ДНК, клонирование и отбор промотора с опреде- , ленной нуклеотидной последовательностью, отличающийся тем, что в качестве фрагментов ДНК используют фрагмент ДНК, кодирующий Р2 промотор ггп-оперона

0

5

0

5

0

5

рибосомальной РНК Escherlchla coll. полученный путем делеции большей части ггп- оперона рибосомальной ДНК, и фрагмент ДНК плазмиды pLBu3, кодирующей последовательность rrn-оперона вне областей -35 и -10, при этом в точке соединения фрагментов создают сайт узнавания рестриктазой Nsl I, по которому удаляют TGCA-последова- тельность, и отбирают промотор со следующей нуклеотидной последовательностью

AGAGAAAATAAATGCTTGACTCTGTAG CGGGAAGGCCGTATTA

область -35 часть происходящая от rrri В

область -10 (минус один Т-нуклеотид)

TGGAATTGTGAGCGGCATAACAATTTC ACACAGGAAACAGCTATGACC

часть происходящая от lac

2, Способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках Escherlchla coif, предусматривающий соединение фрагментов ДНК, кодирующих области регуляции и репликации, промотор, область связывания с рибосомами, селективный маркер и структурный ген, отличающийся тем, что используют фрагмент ДНК, кодирующий промотор с нуклеотидной последовательностью

AGAG ААААТАAATG CTTGACTCTGTAG CGGGAAGGCCGTATTA

область -35 часть, происходящая от rrn В

область -10 (минус один Т-нуклеотид)

TGG AATTGTG AGA CGG С ATA АСААТ Г ACAGGAAACAG CTATCAG С

часть, происходящая от lac и фрагмент ДНК, представляющий собой последовательность гена lac z длиной от О до 100%, и получают вектор pER VI/23, или pERVI/23 PLH4, или pERLI/23 PLH5, или Ртео723,или pLalfa/23, или pERVI/23/- АТС/, или pERVI/23/+ATC/.

н-

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Сущность изобретения заключается в том, что предложен способ получения нового типа промоторов для эспрессии чужеродного гена, которые конструируются из промотора Ра оперона рибосомальной РНК E.cofl и нескольких регуляторных последовательностей, происходящих от tac-оперонэ Е. coll. Сущность изобретения заключается также в том, что осуществляют делецию большей части оперона рибосомольной РНК Е. coll, встроенного в соответствующий вектор, соединяют вместе оставшуюся часть ггп-опе- рона, содержащего промотор Ра. с начальной частью ас-оперона вне областей -35 и -10 и ниже их, с тем, чтобы в точке соединения последовательностей создать новый сайт расщепления эндонуклеазы Nsi. Затем осуществляют делецию внутреннего элемента последовательности TGCA из вновь созданного Nsi-сайта расщепления и встраивают экспрессируемый структурный ген между указанными вновь созданными регуляторными последовательностями. 2 с.п. ф-лы, 10 ил. 1Л С

Р1.2

H-J B16S рВВ9Д9

фиг. 2

фиг.1

. Нуклеотидная последовательность областей присоединения частей различного происхождения в плазмиде Nucleotide sequence of the joining regions of the ports of different originPE - UT/23

in plasmid pER-V /23

Joining region of .the beginning part of the gene for the 16SrRNA molecule and the end-part of the gene for the 23S rRNA molecule in plasmid рВВЭдЗ;

Область присоединения начальной части гена для 165 рРНК-молекулы и к конечной части гена для молекулы 23Ј.рРНК в плазмиде рВВ9д9

GTAGGTGGGGTAACGGC rCArG CfCrC/tGGC CTTAACCTr60

Nucleotide 260 of the mature 16S rRNAlast nucleotide of the mature 235 rRNA&

molecule.molecule „, „„„„IЈ

Нуклеотид 260 зрелой молекулы 16 pPHKпоследний нуклеотид зрелой молекулы 235 pFHK

Joining region of the part of bacterial origin and the part of pBr322 origin in plasmid pfiB9b28 ;Область присоединения части бактериального происхождения и части рВ&-322-происхождения в

ATCCCTGGCAGTATGCAACCCTGrCTCCCCCCTTTCCCTC-4ПЛаЗМИДв

DNA of bacterial origin downstreamnucteotide 2080 of pBR 322

of the rrnB operonНуклеотид 2080 pBP 322

ДНК бактериальнрго происхождения, расположенная ниже г,п В-оперона

Joining region of pBR322 and the promoter region of operon rrnB in plasmid рШ-10 Область присоединения рВБ322 и область промотора оперона ttijB в плазмиде р419.0

САСАТТТСССССААААСТССССЛСТСЛСАСССЛИСАЛГСС nucleotide 4260 of pBR 322promoter region of rrnB

нуклеотид 4260 pBP 322 „. область промотора Ш|В

Фиг. 3

фиё А

фиё.5

р 419 -10

Stul cleavage-расщепление

Ligatton in the presence of uoRl linker .Цитирование в-присутствии Ecol -линкера

(OEcoRI.Hindlll (2) Ligation

лигирование

(I) ( 2)

EcoRI Hind Ш

p.808-2

Фрагмент fragment В (EatfRI-Hjndin ) ;of pLBU3

фиг. б

pER type ptasmids

ра

. . PvtjJI Ligation V -Pvut лиги ованае- Hind Ш

BAL31 digestion

переваривание EcoRl cleavage

1 асщеш1ер 27-10

EcoRl

r-Ecora .- -L-Hindfll

X part cf unknown origin

Pribnow box of the Sac promoter tec operator

lac mRNA ribosome binding-site Hindllt AUG stqrt codon,L

part coding for the N- terminal

part .of /3-gQlctoridase (oc-peptide)

X часть неизвестного происхож

дения

Прибнов-бокс 1ас-промотора 1ас-оператор сайт связывания рибосомы 1ас... .мИПС

AUO-кодон инициации

часть, кодирующая АА-конец часть -галакторидазы -пеп

тид

a./ pER VI/23

AGAGAAAGCAAAMtAAATGCTTGACTCTGTAGCGGGAAGGCCGTATTATGCArCG

-35 region-ю region

35-областъ-10-областъ

Alu I A A TTGTGA GCGGAT-AA CAATTTCA CACAGGAAA CACCTA TCA С С

lac operator -MetThr

lac-оператор aff evu n

половина Р

b./ pER VI/23 f-Nsi AGAGAAAGCAAAAATAAATGCTTGACTCTGTAGCGGGAAGGCCGTATTAT Ј

-35 region-10 region

-35-область-10-ос5ласть

A ATTGTGAGCGCATAACAAfTTCAСА СACGAAACAGСТА ТСАСС

xx-«.«. - «. - --- - - - -

lac operator MetThr

lac-оператор

W7

1836424

WO 89/02466РСТ/НШ8/00061

Nucleotide sequence of the Hind III Hind III polytinker of TTVX origin in the orientation as ift .- l&mict

PLrU

Нуклеотидная последовательность HCkdlll - ШИо ш-гголшшнкера, происходящего от jfV Х-миниплазщды в направлении, полученном для плазмида PLH4

5

HtndlllEcoRI BaraHI

Clal

RAGCTTATCGATGATRAGCTGTCAAACATGAGAATTCGCGCGACCGgATC

10

30

40

20 Pstl

CGGGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCGGAGAACTGGtAGGTATGGAA

60

70

80

Bglll Hindlll

Xbal GATCTCTAGAAGCTT

Фш.8

40

50

100

6/Z3 t-Nsll

lac operator - lac-оператор ribosome binding site сайт связывания

с рибосомой

this region cliffer$ in the individual members of the vector- 1 family QS follows:

TZ Эта область отличается отдель ними членами семейства векторов.