Способ получения L-валина Советский патент 1991 года по МПК C12P13/08 C12P13/08 C12R1/13 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L-валина, который может быть использован в пищевой, химической промышленности и в медицине.

Целью изобретения является повышение выхода продукта.

Способ заключается в следующем.

В качестве штаммов - продуцентов используют мутанты бактерий рода Brevlbacterlum, обладающие устойчивостью к гидроксамату L-аргинина или устойчивостью к гидроксамату L-аргинина и одновременно к высоким концентрациям а-аминомасляной кислоты (АМК) в присутствии L-лейцина.

Примерами штаммов - продуцентов L- валина являются следующие мутанты бактерий рода Brevlbacterlum, депонированные

во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов, штамм В flavum AA52, зарегистрированный год номером ВКПМ В-3713 штамм В flp,um AA51 зарегистрированный под номером ВКПМ В-3714, штамм В. flavum AA54, зарегистрированный под номером ВКПМ В-371Ь

Указанные штаммы получены генетиуо- селегционными приемами из штамма В fiavum ATCC 14067 коллекционный номер ВКПМ R-42).

Предлагаемый способ при использовании мутантов бактерий рода Brevlbacterlum, устойчивых к гидроксэмату L-аргинина, обеспечивает выход L-вапиня до 17 г/л Конкретным примером такого мутанта является штамм - продуцент L-валина В flavum ВКПМ B-37i3 Использование мутантов бактерий рода Brevibacter um устойчивых

одновременно к гидроксамату L-аргинина и к высоким концентрациям АМК в присутствии L-лейцинэ, позволяет достигнуть уровня накопления L-валина в культуральной жидкости по 55 г/л. Примерами таких мутантов могут служить штаммы - продуценты L-валина В. flavum ВКПМ В-3714 или ВКПМ В-3715.

В качестве родительских штаммов для селекции используемых мутантов могут быть любые штаммы бактерий, относящихся к роду Brevibacterlum.

Эффект увеличения продукции L-валина может быть достигнут также в сочетании с другими известными мутациями, способствующими накоплению L-валина в культуральной жидкости (например, в результате мутации недостаточности по L-изолейцину). Конкретная схема селекции штаммов - продуцентов L-валина:

АТСС 14067 (ВКПМ В-42): (родительский штамм, продуцирующий до 2 г/л L-валина)

мутагенез N-метил N -нитро-М-нитрозогуанидином (НГ) и отбор мутантов, нуждающихся в L-изо лейцине для роста АА50

(изолейциновый аук- сотроф, продуцирующий до 4,5 г/л L-валина)

мутагенез НГ и отбор мутантов, устойчивых к гидроксамату L. аргинина (10 мг/мл) АА52 (ВКПМ В-3713) (изолейциновый аук- сотроф.устойчивый к гидроксамату L-аргинина, продуцирующий до 17 г/л L-валина)

мутагенез НГ и отбор мутантов, устойчивых к АМК (55 мг/мл) в присутствии L-лейцина АА53 и АА54 (ВКПМ В-3714 и ВКПМ В-3715) (изолейциновые аук- сотрофы, устойчивые к гидроксамату 1-аргинина и устойчи - вые к высоким концентрациям АМК в присутствии L лейцина, продуцирующие до 52-55 г/л L-валина)

Согласно предлагаемому способу в качестве штаммов - продуцентов L-валина ис- пользуют мутантов, устойчи РЫХ к гидроксама - L-aprnHH.-, Кроме того, в качестве штаммов - продуцентов 1-палина ис0 пользуют мутантов, устойчивых к высоким концентрациям ЛМК в присутствии L-лейцина, т е обнаружено, что высокая валинпрс дуцирующая способность достигается нэ средах с высокими концентрациями АМК

5 (55 мг/мл) только в присутствии L-лейцина выход L-валина у штаммов В.flavum ВКПМ В-3714 и ВКПМ В-3715 повышается поотно шению к исходному штамму от 17 до 52- 55 г/л.

0Штаммы В flavum ВКПМ В-3711 ВКПМ

В-3714 и ВКПМ В-3715 являются также мутантами, нуждающимися в L-изолейцине для роста. Мутации устойчивости к высоким концентрациям АМК в присутствии L-лейци5 на и к гидроксамату L-аргинина и ауксот- рофности по L-изолейцину могут быть помучены с помощью мутагенизации бактерий любу/- известным способом (напои мер, обраооткой НГ или ультрафиолетовым

0 облучением).

Штаммы стабильно сохраняют свои генетические маркеры (устойчивость к гидро- оксамату L-аргинина, устойчивость к а-аминомасляной кислоте в присутствии I

5 лейцина и ауксотрофность по L-изолейцину) и валинпродуцирующую активность в обычных условиях хранения, т.е. при посеве уколом в полужидкий агариэованный МПБ с последующим хранением подслоем вазели0 нового масла как в холодильнике (4 - 8°С), так и при комнатной температ ре в течение 1 года, хранении посевом на скошенном МПА в холодильнике в течение 1-2 мес. Частота реверсии по признаку ауксотроф5 ности по изолейцину у всех трех штаммов - продуцентов равна 1-3 х 10 , ревертантов по остальным двум генетическим признакам в процессе 1,5-годовой работы с продуцентами не обнаружено.

0Штамкы В. flavum ВКПМ В-3713, ВКПМ

В-3714 и ВКПМ В-3715 имеют следующую характеристику,

Культура л ьно-морфологичес кие признаки.

5Клетки овальные длиной 1,7-2,5 мкм.

бесспоровые, неподвижные, грамположи- тельные.

Мясо-пептонный агар. На 2-е сутки рос га при 28°С колонии диаметром 3-4 мм, круглые с гладким краем, центр приподнят

в виде конуса, поверхность гладкая, блестящая, цвет желтовато-кремовый.

Штрих на мясо-пептонном агаре На 2 е сутки рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтовато- кремовый.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре умеренный, в основном на поверхности среды.

Минеральная среда Гловера с глюкозой. Для роста необходим биотип, тиамин и L-изолейцин На 2-е сутки роста при 28°С колонии диаметром 1 мм, цвет свзгло-кре- мовый Рост итри/а нч 2-е умерен ный, плотный, цвет светло кремозый.

На картофеле рост v образование пигмента с желтым оттенком

Желатин не разжижав г

Физиолого-биохими 5ские признаки

Отношение к источникам углерода Хороший рост на глюкозе, сахарозе, мальтоз, Фруктозе, маннозе; слабее на галактозе, рамнозе, сорбозе. сорбите, аммонийной и натриевой солях уксусной кислоты этиловом спирте, не используют лактозу.

Отношение к источникам азота1 ассимилируют аммонийный азот и мочевину

Получение штамм С flavum ВКПМ В- 3713.

Штамм В. flavum АТСГ 14067 выращи вэют в мясо-пептонном бульоне (МПБ) при 30°С с аэрацией цо /:ог тчтра 10 клеток/мл Клетки отмщают о M TU цет рифугироьанием и рес/спендируюг е цчт оатном буфере рН 5 Ъ) К получении суспензии добавляют НГ до конечной KL центрации 300 мкг/мл инкубирую с аэра цией в течение 20 мин при 30СС Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирку L 10 мл МПБ инкубируют с аэрацией 18 ч при 30°С и затем рассеивают на среду гФ 1 состава мг/мл глюкоза 20, Na2S04 2 КтНРСМ 3, КНаР04 1; NH4CI 3 МЩМОз 1 MgS04 x Х7Н200.1; MnSC/jxbHzG 1 x 10 4 био-и, 5 x , тиамин хлорид 1 х 10 4 L-изолейцин 0,2, агар-агар 20, рН 7,4 Среди колоний, выросших на этой среде посте 48 ч инкубации при 30°С, отбиоэют мутант не способный к росту на среде Ns 1, которая не содержит L-изолейцин Полученный изолей- циновый ауксотроф, обозначенный В flavum AA50, вновь обрабатывают НГ и высевают на среду № 1, содержащую также гидроксамат L-аргинина в концентрации 10 мг/мл. Колонии, выросшие на этой среде после 72 ч инкубации, расчищают и проверяют их валинпродуцирующую способность. Один из отобранных таким образом

мутантов, продуцирующий L-валин, обозначен В. flavum ВКПМ В-3713

Получение штаммов В flavum ВКПМ В- 3714иВКПМВ-3715

5Штамм ВКПМ В-3713 мутагенизируют

ИГ и рассеивают на среду Nb 2 следующего состава, мг/мл: глюкоза 10; N32S04 2; К2НР04 3; КН2Р04 1; NH4CI 3: МН4МОз 1; VgS()4 x 7НзО 0,1; MnS04 x 5Н20 1 x

0 РеЬ04х7Н20 1 х биотинбх , тиамин хлорид 1 x L-изолейцин 0,2; L-лейцин 0,2; АМК-55; агар-агар 20 Выросшие колонии очищают и проверяют их валинпродуци- способность в условиях копбоччых

5 ферментации. Два из таких мутантов, продуцирующие повышенные количества 1-ва- /шнгЗ, обозначены как В flavum ВКПМ В 1/14 и ВКПМ В-3715

Посевной материал штаммов - проду0 центов для последующей ферментации может быть приготовлен любым известным способом таким, как выращивание на поверхности твердых агаризованных питательных сред в жмдких питательных средах,

5 содержащих усвояемые источники углерода, азота, неорганические соли и органиче- гкие вещрпза обрспечизэющие рост микрогрг ч

В качестве VCTO HMKOB глеоода могут

0 быть иопочмо: 4ht угле- одь, как са- люсоч . Литоза, ман- нсза крйхмалэ и чрлосса мн i cnnpit, такие как гли - pin i« rpf и r rai .меские кислоты

ifkne, как м кипота. уксусная ч слога, ют - чная иглота, Фумаровая кис- JiOTd малеиновэя к ,слога пропионовая кислота1 спирты таьие как метаноп и эта- HU;I Указанны0 источники углерода могут

0 бытй использованы как е отдельности, так и в сочетании друг с другом в различных весовых соотношениях Общее количество источника углерода может быть введено вначале ферментации либо порциями в проЬ цессе ферментации

В качестве источника азота могут быть н пользованы как органические, так и неор- (анические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат

0 аммония, ацетат аммония, нитрат аммония, фосфат зммония, лактат аммония, аммоний, мочевина, различные природные азотсодержащие соединения, например пептон, гидролизат дрожжей мясной экстракт и

5 гидролизаты растительных белков

В качестве неорганических солей могут быть использованы фосфорнокислый калий, фосфорнокислый натрий сульфат магния, хлорид атрия, соли елеза и марганца, карбонат кальция

В качестве органических веществ, необ ходимых для роста названных штаммов, могут быть использованы тиамин (например, в форме гидрохлорида или бромида), биотин или его заменители (например, дестиобио- тин, биоцин, 7 8-диаминопеларгоновая кислота), з также аминокислоты, если очи необходимы для роста микроорганизмов например L-изолейции. При условии налч- чия органических веществ в достаточном ко- личестве а составе других компонентов питательной среды необходимость внесе ния таких органических веществ в чистом виде отпадает

Ферментационная среда содержи),;/л1 Сахароза ил глюкоза100 20С

Сульфат аммония 0-80

Сульфат магния05 0

Калий фосфорнокислый однозамещенный05 10 L-изолейцин О 0,4 а также сульфат железа, сульфат марганца биотин, тиамин. Накопление L-валина наблюдается через 6-8 ч после начала ферментации. Однако максимальный уровень L-валина в культуральной жидкости достигается в результате полного потребления источника углерода и энергии (через 26 и более после начала ферментации в зависимости от использованной концентрации ис точника ,гперода и лнергии).

Одновременно с васином в культурзль ной жидкости i акапливается ряд аминокислот. Содержание а м и мок исто т а культуральчпй жидкости штэммов-проду центов В. tlavum ВКПМ В-3714 i- ВКПМ В-3715 приведено в таблице.

Содержание L-валина в культурэльной жидкости и других растворах определяют с помощью метода б/мажной хроматографии и окрашивания нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора

Накопленный L-налин можег быть выде лен из культуральной жидкости ЛЮ :УМ известным способом, таким как удаление микроорганизмом и других нерастаоренных частиц центрифугированием или цией, адсорбцией L-аалина на ионообменные смолы с последующими элюированием, концентрированием и кристаллизацией L валина.

Пример 1. Посевной материал штамма В flavum ВКЛМ В-3715 PCTOBPI следующим образом В пробирки, содержащие 10 мл стерильного МПБ (рН 7,5) асепти э ски вносят петлей культуру, выращенную на поверхности МПА. пробирки инкубируют на качалке в течение 16 ч,

В ферментационные колбы о ьвмом 500 мл асептически разливают по Ь мл простеризированной ферментационной среды- или следующего состава, т/гс сахароза 150, (NH4)2S04 55: КН2Р04 0,1; MgS04 X 7Н20 1; СаСО з 50; FeS04 х 7Н20 0,01, MnS04 x 5Н20 0,01; биотин 0,0005; тиамин хлорид 0,0005; L-изолейцин 0,25; рН 7.

В колбы аносят по 1 мл посевного мате- ала j.i-мма ВКПМ Р-3715 и инкубируют на кач«п.о (220 oG/мин) в ечение 96 ч при JO С, Содержание L-взлинэ в культуральной жидкости полученной поспе завершения ферментации Б1} 0 г/л

250 мл полученной кульгу альной жид- м,ч 1И содержащей 1,8 г с-гпииа, центри у ируют ЬСО об/мин в течени 20 мин) Д|1я упаления Гмктерий и других неоэстворимых частиц Получе ный супернят;жт мропуска- ю через юм/н - У г ионообменной смолою в - Форм в направлении снизу- вверх со ( коросгь-о 0 6 бьемов растоорз ия 1 обьем смолы за ч Колонну промывают водой м зчюируют адг орбировс-нный L-ra/. 3 5- %ным водным растзооом аммиака Полученный элюа концентрируют под вакуумом до по- явте1- ля срис 7ллов и дальнейшую кристал- тизациго I папино осущ-эстьпчют при 5СС в Э йчие ч Кристаллы отл,эпчют от раство РИГ , , ,, -ц 1,-эрез фильтр гушат tt чз /умом. В и ход Ьвзлетна со- с.ьвпяет Ь г 6r i его содержания ь , -створе, что да т общий выход от i г f Ky;Tbvvp nbH w жидксст л 63%

-)и.тота прод к-а lanh. 1; бумажной уо .матогг фис 06 6%

П р м ° ; J Пооцесс проводят ана логично примеру 1 только в качестве продуценте используют штамм В. flavum ВКПМ В-3714, з концентрацию сахарозы EJ ферментаиионной среде берут равной 120 i /л Содержание L-оалина в культураль- жидкости после 72 ч инкубации СОСТЭЕ- лчет41 7 г/л.

П и е р 3 Процесс проводят ана- погич.-ю 2 только Р качестве проду- JC.HT.T L-B- липа используют о)тамм В. flavum ВТ1М Содорчание L-еалича -уаь- туральний жидкости по ле 72 ч инкубации составляет 43,5 г/л

Пример 1 Процесс пооводят аналогично примеру 1 только а качестве проду- цег- о L-вялина wen: тьзуют В, flavum Б( 3 171 л Выход L-запина составтяет 52 ) г/г

Пример 5. 1роцесс проводят аналогично примеру 1 только в качестве продуцент L-валина используют штамм В. flavum B vHM 6-37 13. Содержание L-валина в куль- П Г/алььой жидкости 172 r/i,

Пример 6. Процесс проводят аналогично примеру 1, но в качестве ферментационной питательной среды используют среду следующего состава, г/л: меласса 220; гидролизат БВК (паприна) 80; КНаРСм 1; S04 20; мел. 5. Выход L-валина у штамма ВКПИ В-3714 24,8 г/л, а штамма ВКПМ В-3715 26,7 г/л.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет существенно повысить выход продукта и снизить его себестоимость,

Формула изобретения

Способ получения L-валина. предусматривающий выращивание микроорганизма

продуцента из рода Brevlbacterlum в условиях аэрации в питательной среде, содер- жащей источники углерода, азота, минеральные соли и ростовые факторы, до максимального накопления целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, отличающийся тем, что. с целью увеличения выхода продукта, в качестве микроорганизма - продуцента из рода В revlbacter ип используют штамм Brevlbacterlun flavum ВКПМ В-3713 или ВКПМ В-3714. или ВКПМ В-3715.

Изобретение относит я микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L взлина который может быть использован в пкщевой, хпм ческой промышленности и медицине Цепью изобретения является повышение выхода продукта Способ заключается в том, в качестве предке итог- 1-валина ИСЛ ЬЗУЮТ штампы бактерий рода Brewlbacterlurn оЬладачлцие устойчивостью к «идроксзмлу L-af-гинина или устойчивостью к гидроксамаг/ L-аргинина и одновременно к высоким концентрациям ог-эминомдглчний кислоты ЬтК) ь присутствии L чейцина Мутаи j, х с чиьые к гид- родами L-aprnHVr3 (шта лм ВКПМ В-3713), накапливают ь t vu жидкости до 17 г л (.-ва i;s стойчи- в.1Э идоокся б L ар книна и однивр мерно к четким KO-(I;C чтоациям АМК. Р прис/ |Вим I пеи д is (штаммы ВкПМ Б-3714 и ВгПМ до 55 г/л. 1 табл. сл (Г

Редактор И.Дербак

Техред М.Моргентал

Заказ 2976ТиражПодписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 1 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Корректор Э.Лончакова