Способ получения L-пролина Советский патент 1988 года по МПК C12P13/24 C12P13/24 C12R1/13 

4ib

Q Ф О) СП

;о

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения L-пролина при помопц ферментации с использованием мутантов микроорганизмов, продуцирующих L-npo- лин, что является одной из важнейших аминокислот, и используется в медицине.

Цель изобретения - повышение выхода с L-пролина,

Цель достигается путем использования мутантов Brevibacterium flavum устойчивых одновременно к 3,4-деги,ц- ро-В,Ъ-пролину (далее именуется ДП) и повышенному осмотическому давлению среды и неспособных катаболизировать L-пролин, Причем, мутации сообщающие бактериям устойчивость к ДП и повышенному осмотическому давлению сре,цы и мутации, сообщающие бактериям неспособность катаболизировать L-npo пин, как и комбинации этих мутаций обладают положительным эффектом в отношении увеличения уровня выхода L- пролина также в сочетании с иными мутациями, способствующими продукции Ь-пролина, например мутациями ауксо- трофности по L-изолейцику.

Примерами штаммов - продуцентов L-пролина, использованных в предлагаемом изобретении и хранящихся в Центральном музее промьш1ленных микроорганизмов института ВНШгенетика под соответствующими номерами ЦМПМ В являются следующие мутанты Brevibac- Iteriura flavum штамм АР111 (ЦМПМ В- ;3258)Vf штамм АР110 (ЦМПМ В-3318) |штамм АР112 (ЦМПМ В-3258) и штамм |АР113 (ЦМПМ В-3260). Указанные новые штшимы получены генетико-селекционны ми приемами из штамма Brevibacterium flavum ЛТССиОб. Штаммы AP111 и API 12 являются мутантами ; устойчивыми одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, а штаммы AP110 и AT113 - мутанты, устойчивые одновременно к ДП и повьш1енному осмотическому давлению и неспособные катаболизировать L-пролин, Кроме того, штаммы AP111, API 12 и АР113 являются также мутантами, нуждающимися в L-изолейцине для роста. Штаммы АР110, AP111 и AP112 и АР113 сходны, за исключением перечисленных признаков и пролинпродуцирующей способ- ности по своим культурально-морфоло гическим, культуральным и физиологи

5

0

5

0

0

5

0

5

ческим признакам со штяммом Brevibacterium flavum АТСС 14067,

Мутации устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, неспособности катаболизировать L-пролин и ауксотрофности по L-HSO- лейцину могут быть получены поэтапно и в любом порядке с помощью мута- генизации бактерий любым известным способом (например, обработкой N-ме- тил-N -нитро-К-нитрозогуанидином или ультрафиолетовым облучением) на каждом и последующей идентификацией соответствующих мутантов. Указанные мутации могут быть также получены у разных штаммов и совмещены в одном геноме с использованием какого- либо способа генетического обмена, например, слияния протопластов. В качестве соединений повышающих осмотическое давление среды могут быть использованы сахароза или хлориды щелочных металлов например, хлорид натрия.

Штаммы-продуценты L-пролина, использованные в предлагаемом изобретении получают следующим образом,

Пол гчение штамма Breivibacterium flavum АР110,

Штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 выраш,ивают в мясо-пептонном бульоне (далее МПБ) при 30°С с аэрацией до достижения титра 10® клеток/мл. Клетки отмывают от МПБ центрифугированием, промывают цитратным буфером, рН 5,6, вновь осаждают центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере, рН 5,5, К полученной суспензии добавляют Ы-метил-М -нитро-Ы-нит- розогуанидин (далее НГ) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют с аэрацией в течение 20 мин при . Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирки с 10 мл МПБ и инкубируют 18 ч с .аэрацией при 30 С, Полученную мутагени- зированную НГ культуру осаждают центрифугированием и переносят в пробирки cio средой № 1 состава, мг/мл: сахароза 250; Na2.SO 2; 3; . 1; MgS04-7H40 0,1; 5; 1; FeSO x , биотин 2-10 ; тиамина хлорид и ДП 1 ,5, рН 7-,4 с таким расчетом, чтобы начальный титр культуры был равен 10 клеток/мл. Культуру в пробирках выращивают с аэрацией при 30°С до помутнения (4872 ч), затем рассеивают на поверхности среды № 1, содержащей 2% агар-агара и инкубируют 48 ч при 30 С. Один из выросших на этой среде мутантов , вновь подвергают мутагенезу НГ как это описано и высеивают на поверхность агаризованной среды № 2 состава, мг/мл: глюкоза 20; 2; 3; 1; 3; l; ,0 0,1; I-IQ- -, iFeSO yHjO биотин 5-10 ; тиамина хлорид и агар-агар 20; рН 7,4. Отдельные колонии, выросшие на зтой среде через 48 ч инкубации при 30°С, 1троверяют на способность к «росту на среде № 3, которая содержит L-пролин в качестве единственного источника углерода и азота для роста, состав среды № 3, мг/мл: L-пролин 10; Naa.S04. 2; КгНР04 3; 1; ,MgS04 7H20 0,1; MnS04-5H2 0 1 FeS04-7Hj O биотин 5-10 ; тиамина хлорид 1 -10 . и агар-агар 20, рН 7,4. Колонии, неспособные к росту на среде № 3 через 96 ч инкубации -при

О

30 С, проверяют на пролинпродуцирую- щую способность в условиях, указанных в примере 1. Один из отобранных таким образом мутантов обозначен Вге- vibacterium flavum АР 110.

Получение штамма Brevibacterium flavum АР111.

Мутагенизированную культуру штамма А СС 14067 (условия мутагенеза такие же, как при получении штамма АР 110) высевают на среду № 2, которая содержит дополнительно L-изолейцин в концентрации 0,5 мг/мл. Среди колоний, выросших на этой среде через 48 ч инкубации при 30 С отбирают мутант, неспособный к росту на среде № 2, которая не содержит L-изолейцин Полученный изолейциновый ауксотроф вновь мутагенизировали Н7 и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, как описано при получении, штамма AP110, но с той разницей что в среду № 1 вносят вместо 250 мг/мл сахарозы 20 мг/мл глюкозы и 28 мг/мл NaCl, а также 0,5-мг/мл L-изолейцина. Один из отобранных таким-образом мутантов продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозначен Brevibacteriiim flavum АР111.

Получение штамма.Brevibacterium flavum АР 112.

Изолейц1шовый ауксотроф штамма АТСС 14067 ,индуцированный НГ, как описано при получении штамма АР 11 1-,вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенной концентрации сахарозы на среде № 1, как описано. для получения штамма AP110 с той разницей,что среда № 1 содержит 0,5 мг/мп L-изолейцина. Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозначен Brevibacterium flavum AP112.

Получение штамма Brevibacterium flavum АР 113.

У штамма АТСС 14067 отбирают мутант, неспособный катаболизировать L-пролин с помощью приемов, описанных при получении штамма АР 110. На следующем этапе у полученного штамма, неспособного катаболизировать L-пролин, отбирают мутант, устойчивый к ДП и повышенной концентрации сахарозы, с помощью приемов, описанных для получения штамма API 10. У полученного двойного мутанта, который неспособен катаболизировать L-пролин и устойчив к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, отбирают мутант, нуждающийся в L-изолейцине для роста, приемами, описанными при получении штамма АР 111. Один из полученных таким образом мутантов, продуцирующий повьш1енные количества L-пролина, обо- знг.чен Brevibacterium flavum AP113;

Отличительные признаки мутантных штаммов, использованных в предлагаемом изобретении, в сравнении друг с другом и штаммом АТСС 14067 даны в табл. 1.

Способность к катаболизму L-проли.- на определяют по появлению роста в зоне нанесения капель суспензий штаммов, указанных в табл. 1, на поверхности агаризованной среды № 3 (состав среды № 3 указан) после 96 ч инкуба-, ции при 30°С. Появление роста обозначено знаком +, а отсутствие роста знаком -.

Для определения устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды бактерий штаммов, указанных в табл. 1, вносят из расчета 10 клеток/мл в пробирки с жидкой средой № 1 (состав среды № 1 указан), содержащей 250 мг/мл сахарозы и различные концентрации ДП (в случае штаммов API 11, AP112 и AP113 среда № 1 содержит L-изолейцин в концентрации

Oj5 мг/мл). Пробирки инкубируют в те- Ч€1ние 24 ч при 30 С с аэрацией, а за- Т(1М определяют оптическую плотность кз льтур при 540 мкм. Представленные в табл. 1 данные выражены в процентах от оптической плотности культур, вьфащенных в среде № 1, которая не ссщержала ДП.

любым известным способом, таким как удаление бактерий и нерастворимых частиц проточным центрифугированием или фильтрацией, посадка L-пролина на ионообменные смолы с последуюи ими элюцией, концентрированием и кристаллизацией L-пролина,

П р и м е р 1, В ферментационные

Для накопления L-пролина в культу-1 о колбы объемом 250 мл асептически раз- рфльной жидкости мутантов, предлагае- ливают по 10 мп простерилизованной Mtix в данном изобретении, могут быть ферментационной среды следующего сос- использованы любые питательные среды, тава, г/л: сахароза 150; (NH) содержащие усвояемые источники угле- 55; 1; MgS04 7H O 10; СаСО

15 50; FeS04 7H O 0,01; MnSOv5H O

0,01; ZnSO VHgO 0,01; биотин 0,0005; тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбы инокулируют штаммом Brevibacterium flavum АР 110 и инкубируют на качалке 20

рода, азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост микроорганизмов и продукцию L-пpoлинa.

Накопление L-пролина имеет место пфи культивировании в аэробных условиях в достаточно широком диапазоне т(мператур и значений рН, хотя оптимальными являются температуры 28- 3:1°С, а значения рН 6,5-8,5.

Появление L-пролина наблюдается чсфез 8-10 ч после начала ферментации. Однако, максимальный уровень L -пролина в культуральной жидкости достигается в результате полного потв течение 72 ч при 30 С. В полученной после инкубации культуральной жидкости выход L-пролина составляет 40,5 г/л. В этих же условиях штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 про- 25 дуцировал 3,4 г/л L-пролина.

Пример 2. Условия фермента- .ции и состав ферментационной среды, как указано в примере 1, с тем исключением, что в состав среды вносят так

рсбления источника углерода и энергии 30же L-изолейцинв концентрации 0,1 5 г/л

(через 36 ч и более после начала фер-и различные колбы инокулируют штаммам(1нтации в зависимости от использо-ми Brevibacterium flavum АР111, BreВ/1ННОЙ концентрации источника углеро-vibacterium flavum AP112 и Brevibacда и энергии)..terium flavum API 13. Выход L-пролина

Содержание L-пролина в культураль- 35 культуральных жидкостях, полученных

нЬй жидкости определяют с помощью ме-после ферментации указан в табл. 2.

тода бумажной хроматографии и окраши- В.1НИЯ изатином.

Накопленный L-пролин может быть в щелен из культуральной жидкости

I Г

АТСС 14067

- J

AP110 (ЦМПМ В-3317)

100 13

100 76

0,01; ZnSO VHgO 0,01; биотин 0,0005; тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбы инокулируют штаммом Brevibacterium flavum АР 110 и инкубируют на качалке 0

в течение 72 ч при 30 С. В полученной после инкубации культуральной жидкости выход L-пролина составляет 40,5 г/л. В этих же условиях штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 про- 5 дуцировал 3,4 г/л L-пролина.

Пример 2. Условия фермента- .ции и состав ферментационной среды, как указано в примере 1, с тем исключением, что в состав среды вносят такВ аналогичных условиях выход L- пролина у изолейциновых ауксотрофов штамма Brevibacterium flavum АТСС 14067 не превьпиает 20 г/л.

Таблица 1

12 12 67 53

46

Редактор И. Сегляник

Составитель Н, Афанасьева Техред Л.Олийнык

Заказ 3446/26

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Продолжение табл.1

Корректор В.Гирняк

Подписное