Способ получения L-аланина Советский патент 1992 года по МПК C12P13/06 C12N15/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты L-аланина, который может быть использован в сельском хозяйстве, химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Целью .изобретения -является повышение выхода L-аланина. .

Способ заключается в следующем. В качестве продуцентов используют му- тантные штаммы Bravibacterium flavum, обладающие наряду с потребностью в D-аланине устойчивостью к D,L- о -амино- масляной кислоте..

Примерами штаммов продуцентов L- аланина, недостаточных по D-аланину, обладающих устойчивостью к D.L- сс- -аминомасляной кислоте, являются следующие мутанты бактерий вида Brevibacterium flavum: штаммы B.flavum AA5 и АА6, депонированные во Всесоюзной, коллекции промышленных микроорганизмов под номерами ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 соответственно.

Штаммы получены генетико-селекцион- ными приемами из штамма B.flavum ATCC 14067 (коллекционный номер ВКПМ В-42).

Мутации устойчивости к D,L- а- амино- масляной кислоте могут быть либо спонтанными, либо индуцированными в результате обработки микроорганизмов любым химическим (например, М-метил-М1-нитро-М-нитро- зогуанидин) или физическим (например, ультрафиолетовые лучи) мутагеном. Совмещение в геноме микроорганизмов мутации устойчивости к D,L- «-аминсмасляной кислоте и мутации осуксотрофности по D-аланину может быть осуществлено в любой последовательности.

Получение штамма B.flavum ВКПМ В- 3991.

ч

«А

ю

4 ы

СлЭ

Штамм B.flavum ВКПМ В-42 выращивают в мясопептонном бульоне (МГ1Б) при 30°С с аэрацией до достижения титра 109 клеток/мл, клетки отмывают от МПБ центрифугированием и ресуспендируют в цит- ратном буфере (рН 5,5). К полученной суспензии добавляют М-метил-М1-нитро М- нитро зогуанидин (НГ)до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют в условиях аэрирования в течение 20 мин при 30°С. Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирки 6 10 мл МПБ, инкубируют в течение 18 ч при 30°С и рассеивают на поверхности среды следующего состава, мг/мл воды: глюкоза 20; N32S04 2; К2НР04 1; NH4CI з; NhUNOs 1; MgS04 х 7МаО 0,1; MnS04 х 5Н20 1 х FeS04 х 7НаО 1 х биотин 5 х ,- тио- мина хлорид 1 х агар-агар 20; D,L- a- аминомасляная кислота 30; рН 7,4.

Колонии, выросшие на этой среде после 4-5 сут инкубирования при 30°С, выделяют и проверяют их алолзинпродуцирующую способность. Один из отобранных.таким способом мутантов, продуцирующий повышенные количества D.L-аланина, вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, нуждающиеся для роста в D-аланине, известным методом. Штамм B.favum ВКПМ В- 3991 является одним из отобранных таким способом мутантов.

Получение штамма B.flavum ВКПМ В-- 3992..

Штамм B.flavum ВКПМ В-42 обрабатывают НГ и отбирают мутант, нуждающийся в D-аланине. Полученный мутант вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к 0,-а--аминомасляной кислоте, как это описано при получении штамма B.flavum ВКПМ В-3991, но с той разницей, что в состав среды вносят также D-аланин в концентрации 0,1 мг/мл, Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующих повышенные количества -аланина обозначен B.flavum ВКПМ В-3992,

Штаммы-продуценты L-аланина B.flavum ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 по своим культурально-биохимическим признакам не отличаются от исходного штамма B.flavum ВКПМ R-42, за исключением признаков устойчивости к DL- а-амино- масляной кислоте, ауксотрофности по D- аланину и L-аланинпродуцирующей способности.

Штаммы имеют следующую характеристику.

Культураль,но-морфологические признаки.

Клетки овальные, слегка вытянутые, длиной 1,7-2,5 мкм, бесспоровые, неподвижные, грамположительные.

На мясопептонном агаре (МПА) на 2 сут роста при 30°С образуют колонии диаметром 2 мм, круглые, гладкие, окрашенные в желтоватый цвет. .

Штрих на МПА: на 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плот- 0 ная, цвет желтовато-кремовый.

Рост по уколу в МПА: умеренный, в основном на поверхности среды.

Минеральная среда Гловера с глюкозой: для роста необходим биотин, тиамин и 5 D-аланин. 2 сут роста при 30°С колонии ди- . аметром 1 мм, цвет светло-кремовый. Рост штриха на 2 сут умеренный, плотный, цвет светло-кремовый. На картофере рост и образование пигмента с желтым оттенком. 0 Желатину на разжижают.

Физико-биохимические признаки. Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, сахарозу, маннозу, фруктозу, мальтозу; слабее - галантозу, 5 рамнозу, сорбозу, сорбит, ацетат, этанол; не ассимилирует лактозу.

Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот, мочевину.

Факультативные аэробы.

0 Оптимум роста при 30-32°С и рН 7,2- 7,8.

Отношение к антибиотикам: чувствительны к канамицмну, тетрациклину, ампициллину, левомицитину (хлорамфениколу) и 5 стрептомицину,

Отношение к фагам: чувствительны к представителям всех известных на сегодняшний день 7 групп бактериофагов, лизи- рующих B.flavum, которые выделены на 0 производстве лизина (группам ФВ, Нф, Еф, Тф, Лф и Кф). Эти группы охватывают около 10 независимых фагочых изоляторов.

Условия хранения: в лиофилицирован- 5 ном состоянии; в пробирках с 0,7% МПА после посева уколом под слоем вазелинового масла; срок хранения - 2 года; на поверхности скошенного 1,5%-ного МПА в холодильнике при 4°С; пересевы через 1,5 мес.

0 Посевной материал штаммов-продуцентов для поступающей ферментации может быть приготовлен любым известным способом, таким как выращивание на поверхности питательных сред или в жидких 5 питательных средах, содержащих усвояе- мые источники углерода, азота, неорганические соли и органические: вещества, обеспечивающие рост штаммов.

К органическим веществам относятся витамины (биотин, тиамин), а также другие

соединения, в том числе аминокислоты, если они необходимы для роста штаммов-продуцентов. Так, в состав посевных сред для выращивания штаммов ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 необходимо вносить D или D.L-аланин в концентрации не менее 80 мг/л.

В качестве питательной ферментационной среды для культивирования штаммов B.flavum ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 мо- гут быть применены питательные среды, со- держащие усвояемые источники углерода, ацетона, минеральные соли и органические вещества, стимулирующие рост и накопление L-аланина. В качестве усвояемых источ- никое углерода могут быть использованы такие углероды, как сахароза, глюкоза, фруктоза/мальтоза, маниоза, Крахмал, гид- ролизат крахмала и меласса; многоатомные спирты, такие как глицерин и сорбит; орга- нические кислоты, такие как уксусная, молочная, фумаровая, малеиновая; спирты, такие как метанол и этанол. Указанные источники углерода могут быть использованы как в отдельности, так и в сочетании друг с другом в различных массовых соотношениях. Общее количество источника углерода может быть введено в начале ферментации либо порциями в процессе ферментации.

В качестве усвояемого источника азота могут быть использованы как органические, так и неорганические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат аммония, ацетат аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, лактат аммония и аммиак; мочевина; различные природные азотсодержащие соединения, например пептон, гидролизат дрожжей, мясной экстракт и гидролизаты растительных белков.

В качестве минеральных солей могут быть использованы фосфорнокислый калий, фосфорнокислый натрий, сернокислый магний, хлористый натрий, соли железа, марганца, цинка, карбонат кальция.

Накопление L-аланина имеет место при культивиро вании в аэробных условиях в диапазоне температур 20-37°С и значений рН 6,5-9,0.

Появление L-аланина наблюдается чё-. рез 6-10 ч после начала ферментации. Мак- симальный уровень накопления L-аланина в культуральной жидкости достигается в результате полного потребления источника углерода через 32 ч и более (в зависимости от использования концентрации источника уг- лерода). Степень конверсии источника углерода в целевой продукт колеблется от 0,17 до 0,29.

Весь аланин в культуральной жидкости находится в L-форме.

Содержание L-аланина определяют методом бумажной хроматографии и окрашивание нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.

Накопленный L-аланин может быть выделен из культуральной жидкости любым известным способом, таким как удаление клеток микроорганизмов и других нерастворимых частиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией L-аланина на ионообменнике смолы с последующим элю- ированием, концентрированием и кристаллизацией. .

П р и м е р 1. Посевной материал выращивают на посевной среде следующего состава, г/л воды: сахароза 30; сульфат аммония 30; калий фосфорнокислый одно- замещенный 3; сульфат магния х 7Н20 1,-сульфат железа х 7Н20 0,01; сульфат марганца х 5НаО 0,01; биотин 0,0001; тиамина бромид 0,0001; D-аланин 0,25; мел 30; рН 7,2. . - ., . .. . .. . .

Инокулят с концентрацией микроорганизмов 10 клеток /мл, полученный с одно- суточного посева с МПА, вносят в посевную среду в количестве 5%. Культивирование осуществляют в колбах на качалках при 30°С. Продолжительность процесса выращивания посевного материала 16-18.4, при этом концентрация микроорганизмов достигает 2-5 х 1 О9 клеток /мл.

В колбы объемом 250 мл асептически разливают по 10 мл простерилизованной ферментационной среды следующего состава; г/л воды: сахароза 150; (МНфЗСм 55; КН2РСМ 3; MgS04 х 7Н2О 1; D-аланин 0.1; FeSCM х 7Н20 0,01; МпЗСм x 5HaO 0,01; биотин 0,0002; тиамина бромид 0,00005; СаСоз 50; рН 7,5. Каждую колбу инокулируют одним из следующих штаммов: B.flavum ВКПМ В-3991, ВКПМ В-3992 и известный штамм ВКПМ В-3061, нуждающийся в D- аланине, но не обладающий устойчивостью к D, L-a- -аминомасляной кислоте. Выращивание осуществляют на качалке при 30°С в течение 96 ч. Содержание L-аланина в культуральной жидкости штаммов приведено ниже:

П р и м е р 2. Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что концентрация сахарозы в ферментационной среде 120 г/л, а продолжительность ферментации 72 ч.

Содержание L-аланина в культуральнзй жидкости штаммов-продуцентов приведено ниже.

Ф О р.мул а изобретен ия Способ получения L-аланина, предусматривающий выращивание продуцирующего его штамма Brevibacterlum flavum,

нуждающегося в D-аланмне, в условиях аэрирования в питательной среде, содержащей сахарозу, аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый, минеральные соли,О-алз йин,биотин, тиамин, мел и воду, до макси мального накопления целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, о тли чающийся тем, что, с целью повышения выхода L-аланина, в качестве продуцента используют штаммы

Brevlbacterlum fiavum ВКПМ В-3991 или Brevibacterium fiavura ВКПМ В- 3992, дополнительно устойчивые к D,L- Gf-аминомасляной кислоте.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты 1 -аланина, который может быть использован в сельском хозяйстве, химической, фармацевтической и пищевой промышленности. Целью изобретения является повышение выхода L-аланина. Способ заключается в использовании в качестве продуцентов L-аланина штаммов Brevlbacterium flavum ВКПМ В-3991 и B.flavum ВКПМ В-3992 (лабораторные номера АА5 и АА6 соответственно), недостаточных по D-аланину и одновременно устойчивых к D.-L- а- аминомасляной кислоте. На среде с саза розой, аммонийным азотом, минеральными солями и растовыми веществами после 96 ч ферментации выход L-аланина достигает 43.82 г/л.