Способ определения лизоцима в биологической жидкости Советский патент 1991 года по МПК C12Q1/34 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробиологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа.

Способ заключается в использовании твердой гелевой среды, в состав которой наряду с тест-культурой Mlcrococcus lysodelktlcus входит 5,2-6,5% гидрогель трехмерного полиакриламида. Указанная среда, сформированная за определенные промежутки времени, имеет хорошие диффузионные свойства, что позволяет выявлять низкие концентрации лизоцима в исследуемых жидкостях.

Оптимальные дозы акриламида, а также временные параметры формирования гидрогеля определены экспериментальным путем f помощью изучения физико-химических свойств смеси и обнаружения пороговых значений активности лизоцима.

Акриламид берут в разведениях от 5,0 до 6,7%. Время загустевания всех образцов одинаково и составляет не менее двух минут (минимальное время формования смеси).

Оценку оптимальных концентраций полиакриламида проводят по степени прочности консистенции сред, диффузионной способности их и возможности образования одинаковых по объему лунок, Эти показатели характеризуют плотность геля, пригодность его в исследовании жидкостей, что относится к обязательном условиям постановки данного теста.

Диффузионная способность гельсреды определена с помощью стандартного раствора лизоцима, взятого в концентрации 8 мкг/мл. Плотность оценена по величине зон лизиса вокруг лунок, заполненных раство- ром фермента.

Характеристика гидрогеля с различной концентрацией полиакриламида (время формирования среды 2-5 мин) представлена в табЛ. 1.

Смеси, содержащие 5,0-5,1% полиакриламида (ПААГ) имеют мягкую, непрочную консистенцию. Формирование лунок зз- труднего и сопровождается разрывами среды. Это придает им неправильную форму - в виде различных по вытянутости эллипсоидов. Такое некачественное образование лунок препятствует точному измерению зон лизиса.

Образцы, содержащие полиакриламид в количестве 5,2-6,5%, имеют достаточно прочную консистенцию, в то же время формирование лунок не вызывает затруднений. а зоны лизиса являются четкими и хорошо выраженными.

Увеличение до излучаемой составной (6.6-6,7%) приводит к повышению плотности смеси: зоны лизиса оказались меньшими на 4-5 мм, образование лунок нередко сопровождается разрывом среды.

Следовательно, низкие (5,0-5,1 %) и более высокие (6.6-6,7%) концентрации ПААГ не позволяют получить с заданными свойствами гель. Основным физико-химическим требованиям отвечают образцы, содержа- щие 5,2-6,5% указанного компонента смеси. Приведенные результаты согласуются с материалами изучения чувствительности теста.

Частота выявления различных концент- раций лизомина в стандартных растворов представлена в табл. 2.

Как следует из табл. 2, применение образцов гельсреды, содержащих 5,2 6,5 мас.% полиакриламида, позволяет в 96,0- 100.0% случаев выявить минимальные концентрации фермента (0,1 мкг/мл). Чувствительность теста при добавлении в смесь 6,6% ПААГ снижается. С помощью этих образцов гельсреды лизоцим в дозе 0,1 мкг/мл обнаруживается в 25,0% случаев.

На чувствительность теста влияют как различные концентрации ПААГ, так и время сшивки гельсреды (табл. 3). Минимальная продолжительность (2 мин) и последующие временные интервалы образования геля (до 15 мин) не вызывают снижения разрешающей способности данного теста. Однако более длительное (16-20 мин) загустевание

реакционной массы изменяет чувствительность предлагаемого метода - пороговая доза лизоцима увеличивается в 2 раза, а частота положительных результатов при содержании фермента 0,1-0,25 мкг/мл оказывается в 3,1-5,0 раза ниже.

Таким образом, оптимальным содержанием полиакриламида & среде является конце нтрация его 5.2-6,5%, а время формирования епя - от 2-х до 15-;и мин.

Способ осуществляют следующим образом.

Приготовление гельбактериальной среды

В 1 /15 М фосфатный буфер (рН 6,2) вносят акриламид (АА) и M,N -мегилен-бис-ак риламид (МБА) (0.2-0.25%) чтобы получить 5,2-6,5%-ьыи рйс вор суммы эти/ компонентов в конечной реакционной смеси, и N,N,N ,N -тетраметилэтилендиамин ГГМЭД)(01-03%)

Навеску сухой культуры М lysodelkticus (из расчета 0,1-0,15% к объему среды) тщательно растирают с несколькими каплями буфера, переносят в предыдущий раствор с помощью небольшого количества б-/фера и перемешивают

Отде,;ьно в небольшом количрстве буфера ( /5 его общего объема) растворяют навеску калия персулофата (ПСК) (0.08 0,15%) и добавляют к ранее полученной суспензии.

Суспензию выливают на подложку, которой может служить предметное стекпо, дно чашки Петри, любая стеклянная или полимерная пластинка (из расчета 0,2 мл среды на 1 см площади)

Время формирования геля составляет 2-15 мин Пластины с готовой средой можно разрезать на полости различных размеров, которые затем помещать в чашку Петри и использовать по мере надобности

Затем гельпробойнш-ом диаметром 2 мм делают лунки чй расстоянии не менее 1-2 см друг от друга.

Определение пиэоцимз в биологической жидкости.

Испытуемые ripcCi) о количестве 0.003 мл вносят в отдельные лунки с помощью пастеровской пипетки с оттянутым концом или шприцем с иголкой для иньекций, пред метные стекла помещают на дно чашки Петри и инкубируют в 1ермостаге в течение 24 ч, после чего измеряют диаметр зон лизиса вокруг лунки и с помощью калибровочной кривой определяют содержание лиэоцима (в мкг/мл) в испытуемом образце жидкости.

С целью построения калибровочной кривой для каждой новой серии среды изме

ряют зоны лизиса тест-культуры микрококка вокруг лунок, содержащих стандартные разведения (0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0: 4,0; 8,0 мкг/мл) кристаллического лизоци- ма.

Способ определения лизоцима иллюстрируется следующими примерами

Пример 1, В 70 мл 1/15 М фосфатного буфера с рН 6,2 растворяют 5,0 г акри- ламида, 0,2 г МБА и 0,3 мл ТМЭД. Навеску 0,145 г сухой культуры М. lysodelktlcus растирают в ступке с несколькими каплями буфера и смывают б мл буфера в приготовленный раствор. Туда же добавля- ют раствор 0,12 г ПСК в 14 мл буфера. Смесь растворов перемешивают и разливают по 4 мл на предметные стекла. Через 2 мин (время формирования среды) делают по 4 лунки на каждом предметном стекле.

Для построения калибровочной кривой готовят стандартные растворы. Предварительно растворяют 10 мг лизоцима в 50 мл дистиллированной воды (200 мкг/мл). Затем получают раствор с концентрацией 8 мкг/мл (к 2 мл взвеси добавляют 48 мл дистиллированной чоды).

Для приготовления растворов с концентрацией 1,0; 2,0; 4,0 берут соответственно 0,25 мл рабочей суспензии, содержащей Я мкг/мл фермента, и 1,75 мл дистиллированной воды; 0,5 мл взвеси + 1,5 мл воды; 1,0мл рабочего раствора + 1,0 мл воды, более низкие концентрации фермента (0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл) готовят путем разведения стандартного раствора с 1 мкг/мл лизоцима (0,1 мл + 0,9 мл дистиллированной воды; 0,25 мл первого + 0.75 мл воды: по 0,5 мл раствора и воды).

Стандартные растворы лизоцима закапывают в лунки (по 4 лунки на каждую дозу), стекла инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37°С, после чего измеряют зоны лизиса, высчитывают их среднюю арифметическую величину, строят калибровочную кривую на миллиметровой полулогарифмической бумаге, откладывая средние значения диаметров зон лизиса каждого стандартного раствора по оси ординат, а абсолютные значения концентрации взятых растворов (в мкг/мл) по оси абсцисс.

Исследуемую пробу ликвора, взятого от больного острым сеоозным менингитом, по 0,003 мл вносят в 2 лунки, предметное стекло кладут на дно чашки Петри и инкубируют при 37°С. Через 24 ч измеряют диаметры зон лизиса. Зона лизиса тест-культуры М. Lysodeiktlcus вокруг каждой из двух лунок с исследуемой пробой ликвора равняется ,5 мм. По калибровочной кривой это соответствует концентрации лизоцима 0,1 мкг/мл.

Пример 2. Готовят гельсреду, содержащую 6,5% ПААГ со временем сшивки

15 мин. Для этого берут следующие количества ингредиентов, необходимых для приготовления среды: АА 6,25 ггМБА0,25 г, ТМЭД 0,1 мл, ПСК 0,08 г, сухой массы микрококка 0,145 г, буфера 88,8 мл (93.2 г). Все операции

0 проводят описанным в первом примере способом.

Исследуют порцию мочи больного ме- нингококковым менингитом. Величина зоны лизиса М. lysodeikticus вокруг лунки с

5 исследуемым образцом составляет 8 мм, что соответствует концентрации лизоцима 0,25 мкг/мл.

Пример 3. Раствор технического гкриламида имеет рН 7 8 и содержит 8,0%

0 акриламида.

Рзстсор 1 К 1 л указанного раствора прибавляют 14,8 г дигидрофосфата калия КНгРСм и 4,35 г гидрофосфата натрия N32HPCM 2Н20, хорошо перемешивают и

5 фильтруют Получают раствор, имеющий рН 62.

Раствор II. В 5 мл расгвооа 1 растворяют 0.38 1МЛ|1-мети/ ен-бис-метзкр 1лзмидэ и 0,25 мл ТМЭД.

0 Раствор III, В 10 мл фосфатного буфера растворяют 0, (65 г калия персульфата.

Раствори II и III смеыивают со взвесью 0,18 г тест-культуры в 11 мл буферного раствора и выливают на предметные стекла,

5 либо в чашки Петри, либо в гооизонтальную форму из оргстекла Через 5 мин образуется гельбзктериальная смесь, которая содержит 6,5% полиакриламида и 0,15% тест- культуры.

0Исследуют пробу жидкости, взятой с помощью катетера из предстательной железы. Добавление биологического субстрата в гельсред/ сопровождается образованием зоны лизиса диаметром 8 мм, что соответст5 вует концентрации лизоцимз 0,25 мкг/мл.

Сравнительные данные применения известного и данного способов были получены при обследовании 35 больных острыми серозными менингитами вирусной и бактери0 альной зтиопогии. Лизоцимную активность спинномозговой жидкости определили у всех больных, в том числе у 27 из них параллельно изучили содержание фермента и в моче (табл. 4).

5

Формула изобретения Способ определения лизоцима в биологической жидкости с помощью метода диффузии в гелевую среду с использованием тест-культуры Mlcrococcus lysodelktlcus и

оценкой концентрации лиэоцима по размеру зон лизиса тест-культуры, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве гелевой среды используют полиакриламидный сшитый гель с концентрацией 5,2-6,5% и продолжительностью формирования геля 2-15 мин.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к медицинской микробиологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ заключается в том, что обнаружение лизоцима осуществляют путем диффузии его в гелевой среле, содьржящей 5,2-5.5% трехмерного геля поиизкрмл-эмидз и тес -культу- ру Miciococcus lyicoef/cicus Концентрацию лизоцимз епредап-.ют п/тем сравнения размеров зон лизиса с. зонами лизиса, попучен- нмми с испочьзие ЭгЖс М стандартных растворов лизоцимз Чувствительность метода 0,1 мкг/мл пр объеме прсбы 0,003 мл. Л тлбл,

Т а б л и ц а 1

Табли1:а2

ТаблицаЗ

Таблиц