Способ определения активности лизоцима в биологических жидкостях Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 C12N1/36 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к снособам определения активности ферментов, в частности лизоцима, в биологических жидкостях (кровь, моча), и может быть использовано в лабораторной практике и научных исследованиях.

Цель изобретения - повьшение чувствительности способа за счет использования в качестве субстрата убитой, предварительно стандартизованной Micrococcus lysodeicticus.

Способ осугцестБЛяется следующим образом.

Готовят 1,3%-ный раствор агара на вероналмединаловом буфере с рН 8,6; фосфатный буфер с рН 6,2 для получения смывов с косячков и дальнейшего

водяной бане до , и смесь выливают ровным слоем на специальную стеклянную пластину размером 9x12 см

; установленную строго горизонтально. После застывания агара пластину поме щают на трафарет и пробойником вырезают лунки диаметром 3 мм на расстоя нии 15 мм одна от другой. На каждой

10 пластине размещается 35 лунок, из ко торых в 25 вносятся с помощью микрошприца или откалиброванного капилляра Панченкова с оттянутым концом по 6 мл исследуемого материала, а в 10

1В лунок - стандартные растворы, используемые для построения калибровоч ной кривой с содержанием 100, 50, 25, 12,5 мкг/мл кристаллического лизоцима. Пластины инкубируют во влажразведения полученной взвеси до опре- 20 камере (фотокювета, плотно при- деленного стандарта и убитую микробную взвесь Micrococeus lysodeicticus: суточную культуру смывают с косячков 5-6 мл фосфатного буфера.

Полученную густую взвесь, предварительно разлитую до 5 мл в пробир25

крытая стеклом) при 37°С в течение 7 ч.

По окончании инкубации измеряют диаметры зон лизиса. Измерение проводят при косом освещении на темном фоне при помощи штангенциркуля или чертежного измерителя, Уровень лизоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметра зон лизиса от, концентрации лизоцима.

ки, убивают автоклавированием при

давлении в 1 атм в течение 15 мин. Мутность такой взвеси составляет обычно 1,6-1,8 ед. (до автоклавирования более 2 ед, оптической плотности). Уровень мутности исходной взвеси определяют на ФЭК в кювете с расстоянием между рабочими гранями в 3 мм при длине волны 536 нм в пределах 0,7- 1,2 ед, оптической плотности. Из концентрированной взвеси, которая при хранении в холодильнике сохраняет свои свойства два месяца, по мере надобности путем разведения готовится стандартная рабочая взвесь.

Опытным путем установлено, что в реакции может быть использована взве с уровнем мутности 0,7-1,2 ед. оптической плотности.

При мутности ниже 0,7 и выше 1,2 ед, оптической плотности зоны лизиса получаются нечеткими. Наиболее оптимальная мутность 0,9-1,0 ед. оптической плотности. Убитая концент

рированная взвесь может храниться в холодильнике при 0-4 С, не теряя своей активности, до двух месяцев.

Ход определения: 5,5 мл расплав50

Всего обследовано 110 больных различными формами геморрагической лихорадки с почечным синдромом и 45 больных дифиллоботриозом. Предлагае- ленного на водяной бане и охлажденно- способом обследовано также 140 го до 54° С раствора 3%-ного агара здоровых. В норме среднее значение смешивают с 5,5 мл рабочей взвеси активности лизоцима равно 43,34t Micrococeus lysodeicticus (оптичес- tO,66 мкг/мл. Этим же методом опреде- кая плотность 0,9 ед.), согретой на лялась активность лизоцима в моче у

водяной бане до , и смесь выливают ровным слоем на специальную стеклянную пластину размером 9x12 см,

установленную строго горизонтально. После застывания агара пластину помещают на трафарет и пробойником вырезают лунки диаметром 3 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. На каждой

пластине размещается 35 лунок, из которых в 25 вносятся с помощью микрошприца или откалиброванного капилляра Панченкова с оттянутым концом по 6 мл исследуемого материала, а в 10

лунок - стандартные растворы, используемые для построения калибровочной кривой с содержанием 100, 50, 25, 12,5 мкг/мл кристаллического лизоцима. Пластины инкубируют во влаж ° камере (фотокювета, плотно при-

крытая стеклом) при 37°С в течение 7 ч.

По окончании инкубации измеряют диаметры зон лизиса. Измерение проводят при косом освещении на темном фоне при помощи штангенциркуля или чертежного измерителя, Уровень лизоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой, выражающей зависимость диаметра зон лизиса от, концентрации лизоцима.

При этом на оси абсцисс откладывают диаметры зон лизиса, а на оси ординат - концентрацию лизоцима. Измерив диаметр зон лизиса испытуемой пробы, по вычерченному графику находят содержание в ней лизоцима в мкг/мл.

Пример 1, Обследован больной П. с диагнозом геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (тяжелая форма). В остром периоде болезни активность лизоцима в сыворотке крови равнялась 110 мкг/мл, в периоде выздоравливания она уменьшалась до 47,5 мкг/мл.

П р и м е р 2. Исследована сыворотка крови больного Р. с диагнозом дифиллоботриоз. Получено 51,0 мкг/мл лизоцима,

313394464

больных и доноров. В норме активность lysodeicticus, инкубации во влажной лизодима в моче минимальна.камере с последующим измерением диаметров зон радиального лизиса,

Формулаизобретения«

дОтличающиися тем, что, с

Способ определения активности ли-целью повышения чувствительности

водима в биологических жидкостях пу-способа, в качестве субстрата испольтем помещения исследуемой пробы изуют убитую культуру Micrococcus

стандартного раствора лизодима вlysodeicticus, кондентрацию которой

лунки агарового геля, содержащего предварительно стандартизируют на

субстрат, полученный из Micrococcusфотозлектроколориметре.

Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения - повьше- ние чувствительности способа. Раствор агара смешивают с убитой микробной взвесью определенной оптической- плотности и выливают на пластину. Вырезают лунки на пластине и вносят в них исследуемый материал. После инкубации измеряют диаметры зон лизиса. Уровень лизоцима в опытных образцах рассчитывают по калибровочной кривой. 00 со со 4 4 СГ5