Способ обнаружения пероксидаз Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии, конкретно к усовершенствованному способу выявления пероксидаз, который может быть использован при изучении структуры и функций пероксидаз, а также при разработке экспресс-методов диагностики.

Целью изобретения является повышение чувствительности обнаружения.

П р и м е р 1. Пероксидазы выделяют из 7-дневных проростков кукурузы, гомогенизируя растительный материал в 5-кратном объеме трисглицинового буфера рН 8,3, содержащем 30% сахарозы После настаивания в холодильнике в течение 30 мин гомогенат центрифугируют при 10000 g в течение 20 мин, и надосздочную жидкость наносят в количестве 20-30 мклна гелевую пластинку.

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) проводят в 5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ), содержащем 2% амфолинов, с интервалом рН 3 5-9,5, в пластинах размером 110x110x1 мм в горизонтальном положении, Режим ИЭФ 10 мин - 200В; 20 мин - 400В; 30 мин - 800В- 30 мин - 1200В.

После окончания изоэлектрофокусиро- вания или электрофореза пероксидаз в полиакриламидном геле пластину толщиной 1 мм с разделенными изоферментами заливают 002%-ным раствором солянокислого бензидина, приготовленном на 0,1М ацетатном буфере рН 4 7 на 30 мин затем гелевую пластину помещают в 0 1 %-ный раствор пероксида водорода до появления синих полос изопероксидаз После этого пластину опускают на 2-3 с в стабилизирующий раствор и вновь заливают 0,1 %-ным раствором

О

VJ ел XI о ел

|

пероксида водорода, и емкость с гелем ставят в холодильник.

Из испытанных стабилизирующих растворов наиболее эффективным оказывается 1,3-2,5-ный раствор трихлоруксусной кислоты, содержащей 0,3-0,7% сульфосалици- ловой кислоты. Обработка геля данными растворами позволяет сохранять синюю окраску пероксидаз в течение 2-3 недель, при этом гель должен находиться в темноте в холодильнике.

Действие различных стабилизирующих растворев на сохранение окраски пероксидаз показано в табл. 1,

В табл. 2 представлены значения площадей пиков некоторых разделенных иэо- пероксидаз после их сканирования с помощью денситометра, показывающие, что чувствительность предлагаемого способа, выше, чем у известного (гибрид Днепровский 247 MB).

В табл. 3 приводятся данные по соотношению изопероксидаз при сканировании геля.

Из данных табл. 3 видно, что после воздействия на гель стабилизирующего раствора появляется возможность количественно замерить изопероксидазы изоэлектриче- скими точками (ИЭТ) 5,3; 5,7; 6,5, которые не выявляются известным способом, причем новых полос изоферментов не образуется, изоферменты лишь на более длительное время сохраняют синий цвет.

0

5

Использование предлагаемого способа выявления пероксидаз по сравнению с известным имеет следующие преимущества: разделенные изоферменты длительное время сохраняют четкость и синюю окраску, а минорные пероксидазы не исчезают при хранении полиакриламидного геля, что дает возможность использовать гель длительное время в исследовательской работе (сканирование пероксидаз с помощью денситометра, фотографирование, определение относительной электрофоретической подвижности отдельных компонентов). Предел чувствительности способа 10-20 пикокатал, что превосходит известный способ в 2-3 раза

Формула изобретения

Способ обнаружения пероксидаз, включающий электрофокусирование или электрофорез в полиакриламидном геле, обработку его раствором солянокислого бензидина в ацетатном буфере рН 4,7, за- тем 0,1 %-нымраствором пероксида водорода, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности обнаружения, гель после обработки 0,1%-ным раствором пероксида водорода обрабатывают в течение 2-3 с 1,3-4,2%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 0,3-0,7% сульфосалициловой кислоты, и вновь 0,1%- Ным раствором пероксида водорода.

Таблица 1

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к способу выявления пероксидаз, который может быть использован при изучении структуры и функций пероксидаз, а также при разработке экспресс-методов диагностики Целью изобретения является повышение чувствительности обнаружения. Для этого полиакриламидный гель после электрофокусирования или электрофореза белков и обработки его раствором солянокислого бензидина в ацетатном буфере рН 4,7, затем 0,1 %-ным раствором пе- роксида водорода, обрабатывают 1,3-4,2%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 03-0,7% сульфоса- лициловой кислоты в течение 2-3 с и вновь 0,1 %-ным раствором пероксида водорода. Указанные условия позволяют повысить чувствительность способа в 2-3 раза и выявить минорные пероксидазы, которые из-за малого количества не выявлялись известным способом 3 табл

Примечание: ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ССК - сульфосалициловая кислота, Все растворы содержат 0,1% пероксида водорода.

Таблица 2

Таблица 3