Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови Советский патент 1991 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови.

Цель изобретения - повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве субстрата трипсина используют белок азофибрин, продукты расщепления которого образуют в щелочной среде раствор красного цвета, по интенсивности соответствующий протеолитической. активности трипсина, затем добавляют исследуемую сыворотку и по разнице (интенсивности окрашивания) устанавливают уровень ингибиторов трипсина.

Способ осуществляют следующим образом.

Используют следующие материалы и реактивы: плазму или сыворотку крови, разбавленную в 50 раз трис-буфером; азофибрин; трис-буфер (рН-8,1. 0,05 М): в мерной колбе на 1000мл растворяют 1,225/тригид- роксиметиламинометана: в 500 мл дистиллированной11 воды, прибавляют 7.5 мл 10%-ного раствора CaCla и доводят дистиллированной водой до метки, рН 8,1 доводят 1 н. раствором HCi; 1 н. раствор HCI готовят из фиксанала; раствор кристаллического трипсина: 5 мг препарата растворяют в 5 мл трис-буфера (матричный раствор), стабилен при +4°С в течение 5-6 дней, перед исследованием готовят рабочий раствор разбавлением матричного трис-буфера в 20 раз

I

VI ч| Os

(1 мл содержит 50 мкг трипсина); 10 н, раствор гидроксидэ натрия.

К 0,5 мл разведенной сыворотки прибавляют 0,5 мл рабочего раствора трипсина (25 мкг). Для образования комплекса трипсин-ингибитор смесь выдерживают в течение 15 мин при комнатной температуре. Добавляют в пробирку 5 мг сухого азофиб- рина, смешивают и ставят в термостат на 1 ч при37°С, Вынимают из термостата, добавляют 3 мл дистиллированной воды, размешивают и центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости и переносят в другую пробирку, прибавляют 0,05 мл 10 н.гидроксида натрия, колориметрируют на ФЭКе при длине волны 500 нм в кювете 5 мм против воды.

П р и м е р. Из каждой пробирки отбирают по 0,5 мл раствора трипсина, прибавляют по 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и по 5 мг азофибрина, перемешивают, ставят в термостат при 37°С на 1 ч, затем прибавляют 3 мл дистиллированной воды, перемешивают, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Отбирают 3 мл надосадочной жидкости, прибавляют 0,05 мл 10 н.раствора гидроксида натрия w колориметрируют на ФЭКе при длине волны 500 нм против дистиллированной воды в кювете 5 мм.

Оптическая плотность пробы, к которой трипсин реагировал в присутствии сыворотки крови, 0,16, По калибровочному графику находят, что это соответствует 5,48 мкг трипсина. Таким образом, концентрация трипсина, связанная с ингибитором, составляет 25 мкг - 5,48 мкг 19,52 мкг.

Расчет активности ингибиторов трипсина в исследуемой сыворотке производят по калибровочному графику.

Калибровочный раствор трипсина при- веден в табл.1.

Содержание ингибиторов рассчитывают по формуле:

У -

19,5 50 1000 0,5 24000

81,33 мкмоль/л.

где 1,52 - количество связанного трипсина (1 моль трипсина связывается с 1 моль ингибитора); 50 - разведение сыворотки;

24000 - молекулярная масса трипсина;

0,5 - количество разведенной сыворотки в пробе.

Данные воспроизводимости предлагае- мого метода исследования ингибиторов трипсина по исследованию сыворотки крови здоровых лиц приведены в табл.2.

Сравнительные данные содержания ингибиторов трипсина у 32 больных острым панкреатитом, полученные предлагаемым методом и известным, приведены в табл.3.

Формула изобретения

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке крови путем добавления субстрата в исследуемую сыворотку, куда предварительно был добавлен трипсин, с последующим измерением оптической плотности, отличающийся тем. что, с целью повышения точности, в качестве суб- страта используют азофибрин, а оптическую плотность измеряют в щелочной среде.

Таблица 1

Способ определения ингибиторов трипсина в сыворотке кроаи относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть исполь зовано для диагностики острых и хронических воспалительных процессов, обусловленных недостаточностью ингибиторов трипсина в сыворотке крови. Цель - повышение точности. Цель достигается тем, что к 0,5 мл сыворотки крови прибавляют 6,5 мл трипсина

40

Таблица 2

Таблица 3