Способ определения активности антитрипсина в сыворотке крови Советский патент 1975 года по МПК G01N33/16 

1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в клинических и экспериментальных исследованиях.

Известен способ определения активности аптитрипсина путем ипкубации трипсина с исследуемой сывороткой, заключаюш,ийся в определении уменьшения тринсиновой активности по перевариванию казеина.

С целью повышения специфичности и точности результатов, предложено неингибировапный после инкубации трипсин оттитровывать специфической иммунной преципитируюш,ей сывороткой.

Активность антитрипсина определяют следующим образом.

Готовят раствор кристаллического трипсина на 0,85%-ном растворе NaCl в день определения, содержаш,ий 500 мкг препарата в 1 мл, рН раствора 5,5-7,0; 0,3 мл исследуемой сыворотки вносят на дно обычных центрифужных пробирок, затем добавляют 0,2 мл раствора трипсина (100 мкг препарата), размешивают и инкубируют в термостате при 37°С 30 мин. (Ставится три параллельпые пробы. После инкубации пробирки извлекают из термостата и добавляют 0,4 мл специфической иммунной преципитирующей сыворотки, содержаш,ей в 1 мл 0,54 мг белка антител. Иммунную сыворотку перед употреблением осветляют при 10000 д 10 мин. Количества добавленной иммунной сыворотки колеблется в зависимости от количества белка антител в 1 мл. Оно должно быть таким, чтобы 100 мкг прнпсина связывалн все антитела, т. е. в зоне

эквивалентности. Пробы инкубируют при 37°С 30 мин в термостате. Затем их переносят в холодпльник (1-5°С) и выдерживают в течение суток. Контроль 1. Вместо исследуемой сыворотки 0,2 мл раствора трипсина инкубируют

с 0,3 мл 0,85%-ного раствора NaCl, а затем

проделывают те же операции, что и с опытной

пробой. Ставится три параллельных контроля.

К о н т р о л ь 2. К 0,4 мл иммунной сыворотки добавляют 0,5 мл 0,85%-ного раствора NaCl. Ставится два контроля. Спустя сутки пробы и контроли извлекают из холодильника, цептрифугируют при 1500-2000 д 10 мин и отсасывают надосадочную жидкость. Образовавшийся преципитат отмывают от посторонних белков. Для этого во все пробы (опытные и контрольпые) добавляют 0,85%-ный раствор NaCl в объеме реакций. Затем преципитат осторожно взбалтывают, чтобы не

было комков. Снова центрифугируют при 1500-2000 д 10 мин и отсасывают центрифугой. Осадки промывают два раза 0,85%-ным раствором NaC п два раза в дистиллированной воде. Затем определяют количества белка по ЛОУРИ: в каждую пробирку добавля3

ют по 5 мл реактива для растворения преципитата, получаемого вдень опыта путем смешивания 50 мл 2%-ного раствора NaaCOs в 0,1 н. растворе NaOH и 1 мл 0,5%-пого раствора CuSO4-5H2O в 1%-ной сегнетовой соли. Затем добавляют 2 мл 0,85%-ного раствора NaCl через 10 мин 0,5 мл реактива Фолина. Окраска развивается через 30 мин. Фотометрирование производят на ФЭК-М при красном светофильтре.

По полученным экстинциям определяют количество оставшегося неинкубированного трипсина в опытных пробах и количество прореагировавшего трипсина в контроле 1.

Активность аититрипсина определяют по разности количества трипсина, прореагировавшего в контроле 1, где не было ингибитора, и опытной пробе (выражается в мкг ингибированного трипсина).

Предмет изобретепия

Способ определения активности антитрипсина в сыворотке крови путем ее инкубации с трипсином, отличаю ш и йся тем, что, с целью повышения специфичности и точности результатов, неингибированный после инкубации трипсин оттитровывают специфической иммунной преципитирующей сывороткой.