Способ получения иммунных сывороток к вирусу гриппа Советский патент 1991 года по МПК A61K39/42 

1

(21)4650502/13 (22) 10.02.89 (46)07.10.91. Бюл. №37

(71)Научно-исследовательский институт вирусных препаратов АМН СССР

(72)В.Ф.Семенков, О.Н.Агеева и И.В.Голо- влева

(53)615.373(088.8)

(56) Практическая вирусология. - Ред.

Г.Штарке. М.: Колос, 1970. с. 165-170.

Ровнова З.И. Вопросы вирусологии, 1959, 4, стр.465-470.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК К ВИРУСУ ГРИППА (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и вирусологии, и может быть использовано для получения специфических нейтрализующих антител к вирусу гриппа. Цель изобретения - повышение активности сыворотки. Мышей иммунизируют 3-кратно внутримышечно с интервалом 7-10 дней, при этом для 2 и 3 инъекций используют вирус, эмульгированный в полном адьюванте Фрейнда при соотношении вирус:адъювант(5-7):1. 7 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии и вирусологии, и может быть использовано для получения специфических нефтрализующих антител к вирусу гриппа.

Цель изобретения - повышение активности сывороток.

Проводят трехкратную иммунизацию белых мышей внутримышечно с интервалом 7-10 дней, причем для 2 и 3 инъекций используют антиген, смешанный с полным адьювантом Фрейнда при соотношении ви- рус:адъювант (5-7): 1.

П р и м е р 1. Патогенный для мышей вирус гриппа A/PR/8/34 культивируют в куриных эмбрионах. Очищают и концентрируют вирус методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Взвесь концентрированного вируса гриппа используют для введения мышам в мышцу бедра в объеме 0,1-0,15 мл с содержанием белка 2 - 15 мкг/мышь. Для 2 и 3 инъекций к взвеси вируса добавляют полный адъювант Фрейнда при соотношении вирус:адъювант (57):1 и непосредственно перед набором в шприц смешивают взбалтыванием с последующим введением смеси. На 8-10 день после 3 иммунизации у мышей забирают кровь из ретроорбитального сплетения и получают сыворотку, которую инактивируют нагреванием при 56°С в течение 30 мин. Специфические антитела к вирусу гриппа определяют в реакциях вируснейтралйза- ции (РН), торможения геммагглютинации (РТГА) и связывания комплемента (РСК)(см. табл.1).

В реакции преципитации в геле антисы- вороткз дает выраженные линии преципитации с вирусом гриппа (разрушенным).

П р и м е р 2. Метод получения вирус нейтрализующих антител к непатогенному для мышей штамму А/Краснодар/101/59 не отличается от описанного в примере 1. Результаты титрования сывороток представлены в табл.2.

Наличие в полученных антисыворотках вируснейтрализующих антител доказывают методом аффинной хроматографии на им(Л

о

00

со ел ю

муносорбенте, коньюгированным соспеци фическими вирусными антигенами (см. табл.3).

Препарат антител, обогащенный вирус- нейтрализующей активностью, подавляет репликацию вируса гриппа в легких инфицированных мышей и защищает от летального исхода 100% мышей (см.табл.4).

П р и м е р 3. Метод получения вирус- нейтрализующих антител дан в примере 1.

Схема иммунизации в опытах 1--6: 1 инъекция 5 мкг вируса на мышь, через 7 дней 2 инъекция - 10 мкг вируса на мышь, через 7 дней 3 инъекция - 15 мкг вируса на мышь. Гипериммунные сыворотки получают на 9 день после 3 инъекции. В отличие от предлагаемого способа иммунизации (применение адъюванта Фрейнда для 2 и 3 инъекций в указанном соотношении, группы 2 и 3, 5 и 6) используют адъювант Фрейнда в соотношении к взвеси вируса 1:1, что сопровождается более низкими титрами вирусо- нейтрализующих антител (группы 1 и 4) и наличием летальности при иммунизации патогенным вирусом гриппа (группа 1).

Динамика титров вирусонейтрализую- щих антител после 1-5 внутримышечных

Титры специфических антител к вирусу гриппа A/PR/8/34(HINI) после трехкратной иммунизации

Сыворотки получают от 2-5 мышей.

Титры специфических антител к вирусу гриппа А/Краснодар/101/59 после трехкратной иммунитации мышей

Сыворотки получают от 4-6 мышей.

инъекций вируса гриппа A/PR/8/34 приведена в табл.7.

Схема иммунизациии

1 инъекция вируса гриппа в дозе 5 мкг на мышь без адъюванта Фрейнда внутримышечно

через 7-10 дней 2 инъекция вируса гриппа в дозе 5-10 мкг с полным адъюван- том Фрейнда при соотношении вирус: адъювант (5-7):1 внутримышечно

через 7-10 дней 3 инъекция вируса гриппа в дозе 5-15 мкг с полным адъюван- том Фрейнда при соотношении вирус: адъювант (5-7):1 внутримышечно.

Гипериммунную сыворотку получают на 8-10 день после 3 инъекции вируса гриппа. Формула изобретения Способ получения иммунных сывороток к вирусу гриппа путем парентеральной иммунизации животных, отличающийся тем, что, с целью повышения активности сыворотки, иммунизацию проводят трехкратно внутримышечно с интервалом 7-10 дней, при этом для 2 и 3 иммунизации используют вирус, эмульгированный в адъ- юванте Фрейнда при соотношении ви- рус:адъювант (5-7): 1.

Таблица 1

30

Таблица 2

Таблица 3

Распределение биологических активностей в препаратах из фракционированной иммунной

сыворотки

Таблица 4

Сравнение протективной активности препаратов из фракционированной иммунной сыворотки

Примечание. Мыши заражаются интраназально дозой вируса 0,05 мл штамма A/PR/8/34 1500 ЭИДбО. Выживаемость контрольных мышей составляет 16%.

Таблица 5

Титры специфических антител к патогенному A/PR/8/34(HINt) и непатогенному А/Красно- дар/101/59(Н2М2) штаммам вируса гриппа при различных соотношениях адьюванта Фрейнда к взвеси вируса

Таблица 6

Динамика титров вирусонейтрализующих антител при различных интервалах между тремя внутримышечными инъекциями вируса гриппа A/PR/8

Продолжение табл.5

Таблица 7