Изобретение относится к генной инженерии, биотехнологии и медицине. Описан штамм СНО-K1-Н5, являющийся продуцентом рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8), и касается способа получения нового штамма на основе СНО-K1 - СНО-K1-Н5, продуцирующего рекомбинантный белок гемагглютинин вируса гриппа А (H5N8), который может быть использован в медицине и биотехнологии.
С конца 2020 года во всем мире продолжают регистрироваться вспышки вируса высокопатогенного птичьего гриппа подтипа A (H5N1) (клада 2.3.4.4b) как среди диких птиц, так и среди домашней птицы, что приводит к появлению новых вариантов вируса [1]. Об этом свидетельствует эволюция подтипа HPAI A (H5N1), зарегистрированная в провинции Гуандун в 2010 г., и недавнее распространение его генетического реассортанта A (H5N8) среди домашних и/или диких птиц в Японии, Великобритании, Румынии, России и некоторых других странах [2, 3]. Более того, фиксируются случаи заражения млекопитающих, в частности человека. Так, в 2020 в Российской Федерации году были зарегистрированы первые случаи заражения людей генетическим реассортантом вируса гриппа A (H5N8) [3,4].
Для эффективной борьбы с высокопатогенным вирусом птичьего гриппа A (H5N8) необходимо проводить комплексные исследования, направленные как на понимание процесса, лежащего в основе постоянной антигенной изменчивости, эволюции, патогенности и передачи у животных и людей, так и на анализ структурных особенностей поверхностных белков вируса, которые будут использованы при разработке вакцины.
Известно, что гемагглютинин (НА) является основным действующим компонентом вакцин против вирусов гриппа, индуцирующий протективный иммунитет [5, 6].
Известны плазмидная генетическая конструкция pVEAL3-10H10ch, штамм рекомбинантной клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-10H10ch и химерное антитело 10H10ch против вируса клещевого энцефалита, продуцируемое указанным штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка CHO-K1-10H10ch (патент на изобретение RU 2800471, МПК C12N 15/00, опубл. 21.07.2023 г.).
Однако выше приведенное изобретение не предназначено для получения белка гемагглютенина вируса гриппа А.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является гемагглютининовый антиген вируса птичьего гриппа А, штамм клеток яичника китайского хомячка СНО, экспрессирующий его, способ получения гемагглютенина и вакцина на его основе и относится к области биотехнологии (патент CN 109111508, МПК C12N 15/85, опубл. 19.09.2018 г.) [9]. Гемагглютининовый антиген вируса птичьего гриппа представляет собой белок гемагглютинин, экспрессируемый последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 1, и имеет преимущество широкого спектра действия в качестве антигена, а белок гемагглютинин представляет собой апротеин, экспрессируемый эукариотической клеткой, так что можно избежать конформационного эпитопа, который теряет антиген. Способ получения гемагглютининового антигена вируса птичьего гриппа и штамм клеток, экспрессирующий гемагглютининовый антиген вируса птичьего гриппа, позволяют получить белок гемагглютинин, имеющий широкий спектр и антигенную иммуногенность. Вакцина на основе гемагглютининового антигена вируса птичьего гриппа имеет низкую себестоимость производства и высокую иммунологическую эффективность.
После иммунизации SPF цыплят в возрасте от 3 до 4 недель антиген подтипа Н5 можно обнаружить на 14-й день, чтобы определить средний геометрический титр (GMT) антитела HI (GMT) не менее 1:64, что превосходит обычные вакцины.
Однако при проектировании белка использовали только наиболее консервативные эпитопы гемагглютенина штаммов вируса гриппа A (H5N1), секвенированные в период с 2013-2018 год.
Техническим результатом заявляемого изобретения является расширение спектра профилактических средств против вируса гриппа А (H5N8) и его серологической диагностики путем создания более современного штамма-продуцента на основе клеток яичника китайского хомячка - СНО-K1-Н5, продуцирующего рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8), который сохраняет свои антигенные свойства, обладает иммуногенными и протективными свойствами.
Технический результат достигается путем получения интегративной плазмидной ДНК pVL3-HA/H5, имеющей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1 размером 5989 п.н., молекулярный вес 3 700 705 Да, содержащей целевой ген, кодирующий белок гемагглютинин вируса гриппа А, обеспечивающей экспрессию и секрецию рекомбинантного гемагглютинина с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4 вируса гриппа А (H5N8) в клетках млекопитающих и содержащая в соответствии с физической и генетической картой следующие элементы:
- ori - участок начала репликации, имеющий координаты с 5381 по 5968 п.н.;
- энхансер с координатами с 369 по 733 п. н. и промотор CMV с координатами с 734 по 937 п.н.;
- 5'SB и 3'SB - сайты связывания транспозазы SB, имеющие координаты с 88 по 368 п.н. и с 4039 по 4316 п.н. соотвественно;
- rHA/Н5 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8) с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4, имеющая координаты с 1026 по 2657 п.н.;
- EMCV IRES - участок внутренней посадки рибосомы, имеющий координаты с 2733 по 3307 п.н.;
- PuroR - последовательность, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину, имеющая координаты с 3320 по 3919 п.н.;
- SV40 poly(A) signal - последовательность, необходимая для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования, имеющая координаты с 3954 по 4075 п.н.;
- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, позволяющий нарабатывать плазмиду в Е. coli и имеющий координаты с 4560 по 5375 п.н.
Интегративная плазмидная ДНК pVL3-HA/H5 в комплексе с плазмидой SB100 (Addgene) позволяет осуществить эффективную интеграцию целевого гена в геном клеток СНО-K1, обеспечивающих высокий и стабильный уровень синтеза рекомбинантного гемагглютинина в форме тримеров.
Технический результат достигается также созданием рекомбинантного штамма клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-Н5, содержащего плазмидную ДНК pVL3-HA/H5 по п. 1 с интегрированной нуклеотидной последовательностью rHA/Н5 и обеспечивающего экспрессию и секрецию гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) в форме тримеров.
Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4, продуцируемого штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-Н5 по п. 2, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и предназначенного для создания профилактических препаратов против вируса гриппа A (H5N8) и его серологической диагностики.
При проектировании белка гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4 удаляли трансмембранный и цитоплазматический домены [5]; сайт расщепления (cleavage site) между НА1 (головной домен) и НА2 (стебель) PLREKRRKRG заменяли на PQRETRG для сохранения нерасщепленного белка; на С-конце добавляли Т4 тримеризующий домен для стабилизации структуры тримера [7, 8] и поли-His-tag для последующей очистки [9], имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг. 1. Физическая и генетическая карта плазмиды pVL3-HA/H5.
Фиг. 2. Электрофореграмма разделения очищенного рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5, полученного в штамме-продуценте СНО-K1-Н5, в ПААГ в денатурирующих и нативных условиях:
Дорожка 1 - маркер молекулярных масс Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-rad, США);
Дорожка 2 - очищенный препарат рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5 в денатурирующих условиях;
Дорожка 3 - очищенный препарат рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5 в нативных условиях;
Фиг. 3. Вестерн-блот анализ очищенного рекомбинантного гемагглютинина Н5, полученного в штамме-продуценте СНО-K1-Н5:
Дорожка 1 - маркер молекулярных масс Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-rad, США);
Дорожка 2 - очищенный препарат рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5, выявленный с помощью сыворотки хорька, зараженного вирусом гриппа A (H5N8).
Фиг. 4. Титры антител в сыворотке иммунизированных животных. В качестве антигена для сорбции в ИФА был использован рекомбинантный белок rHA/Н5. rHA/Н5 - группа животных, иммунизированных рекомбинантным гемагглютинином rHA/Н5; H5N8 virus - группа животных, иммунизированных инактивированным вирусом гриппа A (H5N8); интактные животные - группа животных, не подвергавшиеся никаким манипуляциям.
Фиг. 5. Вируснейтрализующая активность иммунных сывороток в отношении вируса гриппа A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8). Рекомбинантный белок rHA/Н5 - группа животных, рекомбинантным гемагглютинином rHA/Н5; инактив. вирус гриппа A (H5N8) - группа животных, иммунизированных инактивированным вирусом гриппа A (H5N8); интактные животные - группа животных, не подвергавшихся никаким манипуляциям.
Фиг. 6. Кривые выживаемости, полученные в различных группах иммунизированных животных после заражения штаммом вируса гриппа A/Astrakhan/3212/2020 (H5N8). Рекомбинантный белок rHA/Н5 - группа животных, рекомбинантным гемагглютинином rHA/Н5; инактив. вирус гриппа A (H5N8) - группа животных, иммунизированных инактивированным вирусом гриппа A (H5N8); интактные животные - группа животных, не подвергавшихся никаким манипуляциям.
Фиг. 7. Нуклеотидная последовательность плазмидной ДНК pVL3-НА/Н5.
Фиг. 8. Аминокислотная последовательность рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8).
Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления.
Пример 1. Конструирование плазмиды pVL3-HA/H5, обеспечивающей синтез и секрецию гемагглютинина вируса гриппа А (H5N8) в форме тримеров
На основе вектора pVL3 получали интеграционную плазмиду pVL3-НА/Н5 (фиг. 1), содержащую последовательность гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8). Для конструирования рекомбинантного белка использовали последовательность гена, кодирующего полноразмерный белок гемагглютинин Н5, источником которого стал вирус A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (EPI_ISL_1114749).
При проектировании аминокислотной последовательности рекомбинантного гемагглютинина из природной последовательности удаляли трансмембранный и цитоплазматический домены [5]; сайт расщепления (cleavage site) между НА1 (головной домен) и НА2 (стебель) PLREKRRKRG заменяли на PQRETRG для сохранения нерасщепленного белка; на С-конце добавляли Т4 тримеризующий домен для стабилизации структуры тримера [7, 8] и поли-His-tag для последующей очистки [9]. В результате была спроектирована аминокислотная последовательность белка гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4, обозначенного как rHA/Н5. Ген rHA/Н5, кодирующий rHA/Н5, синтезировали и встраивали в вектор pVL3 по сайтам AsuNHI и SalI. В результате была получена ДНК-конструкция, кодирующая rHA/Н5, обозначенная как pVL3-HA/H5 (фиг. 1) и имеющая последовательность SEQ ID NO: 1 (фиг. 7).
Пример 2. Получение штамма СНО-K1-Н5, продуцирующего гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8)
Штамм СНО-K1-Н5 получен на основе клеточной линии СНО-K1 с использованием разработанной конструкции pVL3-HA/H5. Клетки СНО-K1 растили в инкубаторе при 5% содержании СО2 и 70%-ной влажности. При достижении 80%-й плотности монослоя проводили трансфекцию клеток смесью плазмид pVL3-HA/H5 и pCMV(CAT)T7-SB100, взятых в соотношении 10:1, с помощью Lipofectamine 3000 (ThermoFisher, США) в формате 12-луночного планшета в соответствии с инструкцией производителя. Через 48 часов после трансфекции добавляли селективный антибиотик пуромицин в концентрации 10 мкг/мл и осуществляли селекцию устойчивых клеток, в которых произошла интеграция. Затем полученную поликлональную культуру рассевали в 96-луночный плоскодонный культуральный планшет в концентрации 1-2 клетки/200 мкл в среде DMEM/F12 (Servicebio) с содержанием 10% фетальной бычьей сыворотки (HiMedia) и 10 мкг/мл пуромицина (Invivogen) и растили до достижения монослоя. В результате, были получены монокультуры СНО-K1-Н5, которые подвергали криозаморозке.
Характеристика рекомбинантного штамма СНО-K1-Н5.
Морфология: веретеновидные и эпителиоподобные клетки с круглыми ядрами, содержащими от 1 до 2 ядрышек.
Способ культивирования: монослойный.
Среда для культивирования: питательная среда DMEM/F-12 (1:1) - 90%, сыворотка крови плодов коровы - 10%.
Температура культивирования: 37°С.
Посевная концентрация: 100 тыс.клеток в 1 мл.
Метод снятия: 0,25% трипсин (1/3) и 0,02% версен (2/3).
Кратность рассева: 1:3.
Частота пассирования: 3-4 суток.
Условия криоконсервации: питательная среда DMEM/F-12 (1:1) - 50%, сыворотка крови плодов коровы - 40%, ДМСО - 10%.
Режим замораживания: при температуре 4°С - 1 ч, минус 80°С - 12 ч, минус 196°С.
Условия хранения: в криопробирках в количестве 5 шт. хранится в жидком азоте при температуре минус 196°С.
Номер пассажа в жидком азоте: 4.
Жизнеспособность после криоконсервации: 85-90%.
Маркерый признак: наличие в культуральной среде рекомбинантного белка гемагглютинина rHA/Н5 вируса гриппа A (H5N8) размером ~75 кДа, подтверждается с помощью белкового электрофореза и иммуноблотинга.
Область применения: биотехнология.
Пример 3. Наработка и очистка рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8)
Моноклональную культуру СНО-K1-Н5 культивировали в роллерных флаконах при 37°С на среде DMEM/F-12 (Servicebio), дополненной 5% FBS (Himedia) в течение 7 дней. Затем собирали культуральную среду и осуществляли очистку белка.
Очистку рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5 проводили с помощью металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni-NTA (Qiagen). Перед загрузкой образца культуральную среду центрифугировали для удаления клеточного дебриса в течение 15 мин при 5000 об/мин при 4°С. После этого, супернатант разбавляли 1:1 связывающим буфером (20 мМ Na2HPO4, 0.5 М NaCl, рН 7.4) и загружали на колонку. Затем колонку промывали промывочным буфером (20 мМ Na2HPO4, 0.5 М NaCl, 30 мМ имидазол, рН 7.4). Целевой белок элюировали буфером для элюции (20 мМ Na2HPO4, 0.5 М NaCl, 500 мМ имидазол, рН 7.4). Степень очистки целевого белка оценивали с помощью электрофореза в 12% ПААГ с последующей фиксацией и окрашиванием Кумасси G250. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли и диализовали против PBS (Neofroxx). Затем проводили количественную оценку препарата белка по методу Брэдфорда с использованием спектрофотометра путем измерения оптической плотности при 260/280 нм.
Сохранение антигенных свойств очищенного гемагглютинина rHA/Н5 подтверждали с помощью вестерн-блот анализа. Вестерн-блот анализ проводили с использованием системы SNAP i.d. 2.0 (Millipore) в соответствии с методикой производителя. В качестве первичного антитела была использована сыворотка хорька, зараженного вирусом гриппа A (H5N8) (разведение 1:100), в качестве вторичного - осажденные иммуноглобулины из сыворотки мыши (разведение 1:3000) и козьи антимышиные иммуноглобулины G, конъюгированные с щелочной фосфатазой (1:5000). Визуализацию иммунного комплекса осуществляли субстратом 1-Step™ NBT/BCIP (Thermo Scientific).
В результате было подтверждено, что гемагглютинин вируса гриппа А (H5N8) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 (фиг. 8) после очистки и последующего диализа остается в растворимой форме в виде тримеров и сохраняет свои антигенные свойства (фиг. 2, фиг. 3).
Пример 4. Иммуногенность рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8).
Работа с животными проводилась в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных». Протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Протокол БЭК №1 от 21.03.2023).
Для оценки иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) использовали самок мышей BALB/c массой 16-18 г. Животные были разделены на три группы (по 10 особей на группу), которых иммунизировали внутримышечно дважды с трехнедельным интервалом. Первой группе вводили 50 мкг очищенного рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5, ресуспендированного в физиологическом растворе, в присутствии полного адъюванта Фрейнда (1-я иммунизация) и неполного адъюванта Фрейнда (2-я иммунизация) (Sigma) в общем объеме 100 мкл. Второй группе вводили инактивированный вирус гриппа A (H5N8) внутримышечно также в комплексе с полным (1-я иммунизация) и неполным адъювантом Фрейнда (2-я иммунизация) в общем объеме 100 мкл в качестве положительного контроля. Третья группа состояла из интактных животных. Через 14 дней после второй иммунизации осуществляли забор крови из ретро-орбитального синуса. Сыворотку отделяли от клеточных элементов центрифугированием (9000 g, 15 мин), нагревали в течение 30 мин при 56°С и исследовали на наличие антител, специфически связывающихся с белком rHA/Н5 в ИФА. Образцы также были проанализированы на их нейтрализующую активность.
Для ИФА rHA/Н5 сорбировали на 96-луночные планшеты (Corning, США) в концентрации 1 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. Планшеты трижды промывали и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре с 1% казеина в PBS с 0,05% Tween 20 для блокирования неспецифического связывания белка. Затем планшеты инкубировали с трехкратными серийными разведениями мышиной сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре, после промывки PBST добавляли кроличьи антимышиные IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США), разведенные 1:3000, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После окончательной промывки планшеты проявляли добавлением субстрата ТМВ (Amresco, США). Реакцию останавливали 1N HCl и анализировали при 450 нм на многорежимном ридере для микропланшетов Varioskan LUX (Thermo Fisher Scientific, США).
По результатам ИФА в конечной точке эксперимента средние титры НА/Н5-специфических антител в группе животных, иммунизированных рекомбинантным белком rHA/Н5, составили 1:500 000 (фиг. 4).
Нейтрализующие свойства сывороток крови определяли по ингибированию цитопатического действия (ЦПД) вируса в культуре клеток in vitro [5]. Через двое суток после начала инкубации клеток MDCK со смесью серийных разведений сывороток и 100 TCID50/лунка штамма A/turkey/Stavropol/320-01/2020 клетки окрашивали раствором кристаллического фиолетового (1,3 г красителя растворяли в 50 мл 96% этилового спирта, доводили дистиллированной водой до 700 мл и добавляли 300 мл 40% раствора формалина) и анализировали с помощью многорежимного ридера для визуализации клеток Agilent BioTek Cytation 5 (Thermo fisher scientific). За титр нейтрализации принимали значение самого высокого разведения сыворотки, при котором достигается >50% нейтрализация вируса, что соответствует >50% жизнеспособных клеток.
В результате было установлено, что сыворотки животных, иммунизированных рекомбинантным гемагглютинином rHA/Н5, способны нейтрализовать живой вирус гриппа штамм A/turkey/Stavropol/320-01/2020 со средним титром 1:2260 (фиг. 5).
Пример 5. Исследование способности рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A (H5N8) защищать от заражения вирусом A/turkey/Stavropol/320-01/2020 (H5N8) после иммунизации животных.
Анализ способности рекомбинантного гемагглютинина rHA/Н5 защищать от заражения вирусом был проведен с использованием мышей линии BALB/c, которые являются чувствительными к заражению вирусом гриппа A/Astrakhan/3212/2020 (H5N8). Через 14 дней после второй иммунизации, мышей заражали интраназально дозой 20 МЛД50 штаммом вируса гриппа A/Astrakhan/3212/2020 (H5N8), гомологичного исследуемому штамму. Манипуляции по заражению мышей проводили на фоне наркоза смесью препаратов Золетил100 и Ксила. Наблюдение за животными после заражения осуществлялось ежедневно в течении 14 дней после заражения, одновременно вели наблюдение за клиническими признаками в качестве индикатора заболевания (активность, аппетит) и гибелью.
По итогам проведенного эксперимента установлено, что протективность в группах мышей, иммунизированных рекомбинантным гемагглютинином rHA/Н5, составила 100% (фиг. 6).
Источники патентной и научно-технической информации
1. Mahmoud S.Н. et al. Immunogenicity and Cross-Protective Efficacy Induced by an Inactivated Recombinant Avian Influenza A/H5N1 (Clade 2.3. 4.4 b) Vaccine against Co-Circulating Influenza A/H5Nx Viruses // Vaccines. - 2023. - Т. 11. - №. 9.
2. Zhao K. et al. Characterization of three H5N5 and one H5N8 highly pathogenic avian influenza viruses in China // Veterinary microbiology. - 2013. - T. 163. - №. 3-4. - C. 351-357.
3. World Health Organization. Human infection with avian influenza A (H5N8)-the Russian Federation. Disease Out-break News. [Электронный ресурс]. 2021. URL: https://www.who.int/emergencies/disease-outbreak-news/item/2021 - DON313 (дата обращения 25.10.2023).
4. Pyankova О.G. et al. Isolation of clade 2.3. 4.4 b A (H5N8), a highly pathogenic avian influenza virus, from a worker during an outbreak on a poultry farm, Russia, December 2020 // Eurosurveillance. - 2021. - T. 26. - №. 24.
5. Yamada S., Yasuhara A., Kawaoka Y. Soluble recombinant hemagglutinin protein of H1N1pdm09 influenza virus elicits cross-protection against a lethal H5N1 challenge in mice // Frontiers in microbiology. - 2019. - T. 10.
6. Chen Т.H. et al. Recombinant hemagglutinin produced from Chinese Hamster Ovary (CHO) stable cell clones and a PELC/CpG combination adjuvant for H7N9 subunit vaccine development // Vaccine. - 2019. - T. 37. - №. 47. - C. 6933-6941.
7. Lu Y., Welsh J.P., Swartz J.R. Production and stabilization of the trimeric influenza hemagglutinin stem domain for potentially broadly protective influenza vaccines // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - T. 111. - №. 1. - C. 125-130.
8. Ecker J.W. et al. High-yield expression and purification of recombinant influenza virus proteins from stably-transfected mammalian cell lines // Vaccines. - 2020. - Т. 8. - №. 3. - C. 462.
9. Bornhorst J.A., Falke J.J. [16] Purification of proteins using polyhistidine affinity tags // Methods in enzymology. - Academic Press, 2000. - T. 326. - C. 245-254.
10. Патент CN 109111508, МПК C12N 15/85, опубл. 19.09.2018 г. (прототип).
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Приложение_H5,
strain CHO-K1-H5, protein.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.3.0" productionDate="2024-02-02">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>12345678</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-02-02</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>1234</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>1234576</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-01-28</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение
науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
«Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Роспотребнадзора)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federalnoe byudzhetnoe uchrezhdenie nauki
"Gosudarstvennyj nauchnyj tsentr virusologii i biotekhnologii
"Vektor" Federalnoj sluzhby po nadzoru v sfere zashchity
prav potrebitelej i blagopoluchiya cheloveka (FBUN GNTS VB
"Vektor" Rospotrebnadzora) (RU)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="en">Рекомбинантная плазмидная ДНК
pVL3-HA/H5, несущая ген гемагглютинина вируса гриппа А (H5N8),
рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка
CHO-K1-H5 и рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8),
продуцируемый штаммом CHO-K1-H5 и предназначенный для создания
профилактических препаратов и серологической диагностики вируса
гриппа A (H5N8)</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>5989</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..5989</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cgaagaaaggcccacccgtgaaggtgagccagtgagttgattgcagtcc
agttacgctggagtctgaggctcgtcctgaatggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacac
ttaagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttg
gcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtttacagacagat
tatttcacttataattcactgtatcacaattccagtgggtcagaagtttacatacactaagttcgactcc
tctgcagaatgcggcgatgtttcggtaaggggtccgctactagttattaatagtaatcaattacggggtc
attagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccg
cccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttcc
attgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgcc
aagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctta
tgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggc
agtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaa
tgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaaccca
ctgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctggctagcgccaccatgg
aaaacatcgtactgcttctagcaatagtctccctagtaaagtccgatcagatttgtatcggctaccatgc
caacaattccacagagcaggtggatactatcatggaaaagaacgtcaccgtgacccacgctcaggatatt
ttagaaaaaacccataacggtaaactatgtgacctgaatggagtaaagccactcatcctgaaggattgta
gcgtcgccggctggctcctcgggaatccaatgtgtgacgagttcatcagagtgccggagtggtcatatat
cgtcgagagggccaaccccgctaacgatctttgttaccctggtagtcttaatgactatgaagaattgaag
cacctcttaagtcggattaaccatttcgagaaaattctgatcatacccaagtctagttggcctaaccacg
aaactagcttgggagtatccgctgcctgtccttatcagggcgctcccagcttttttcgaaacgtcgtctg
gctgataaagaagaatgacgcttatcctaccattaagatatcctataataataccaatcgcgaagacctg
ttgattttgtggggcatccatcattcaaacaacgctgaagaacaaaccaatctgtacaaaaatcccacaa
catacatttcagtgggaaccagtaccctgaaccagcgcctggtcccaaaaattgcaactcgcagtcaagt
aaatggacagcgtggcagaatggattttttctggacaatcttaaaaccagacgatgcaattcattttgag
tccaacgggaattttattgcgccagaatacgcctacaagatagtgaaaaaaggagacagcactataatga
agtccggagtggagtacgggcactgcaacaccaaatgtcagactcctgtgggcgcgatcaacagcagcat
gccattccacaatatccaccccctgactattggagagtgtcctaagtatgtgaagtccaataaactggtc
ctcgcaactggactgagaaacagtccactcagagagaaaggcctctttggagctattgccgggttcattg
agggcggatggcaaggaatggtggatgggtggtacggctatcatcatagtaatgaacagggtagcggcta
tgcagcggacaaagaaagtactcagaaggccattgatggtgttaccaacaaagtaaactcaatcattgat
aaaatgaatacacagtttgaggccgtgggcagagagttcaataatctggagcgtaggatagaaaatctca
ataagaagatggaggatgggttcctagacgtttggacctacaacgctgaattgttagtgttgatggagaa
cgagcgcaccctcgacttccacgacagcaatgtgaagaacctctatgataaagtgagacttcaattaaga
gataatgcaaaggagcttggcaacggatgttttgagttttatcataagtgtgacaatgaatgcatggagt
cagtccgtaacggcacctacgattaccctcagtatagtgaagagggctacatccctgaggcccctagaga
tggccaggcctatgtgagaaaggatggcgagtgggtgctgctgtctacctttctgcatcaccaccatcat
caccatcaccaccactaagtcgaccgagcggttcccgcccctctccctcccccccccctaacgttactgg
ccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtctttt
ggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcg
ccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaac
aacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaag
ccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgg
aaagagtcaaatggctcacctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattg
tatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctag
gccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatgaccg
agtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgc
gttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctg
caagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcgg
tggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggc
cgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaag
gagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccg
tcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccg
caacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgc
acctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgattcgcatatgggttaatgcttcgagcagacatgataa
gatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttg
tgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttcctcgacctctagctagagct
actcgggaccccttaccgaaacatcgccgcattctgcagaggagtcgagtgtatgtaaacttctgaccca
ctgggaatgtgatgaaagaaataaaagctgaaatgaatcattctctctactattattctgatatttcaca
ttcttaaaataaagtggtgatcctaactgacctaagacagggaatttttactaggattaaatgtcaggaa
ttgtgaaaaagtgagtttaaatgtatttggctaaggtgtatgtaaacttccgacttcaactgtataggga
tccgctcaatactgaccatttaaatcatacctgacctccatagcagaaagtcaaaagcctccgaccggag
gcttttgacttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgt
attttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatgagccatattcaacgggaaacgtct
tgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatg
tcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaaca
tggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcaggctaaactggctgacggaatttatg
cctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccag
ggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagt
gttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacggcgatcgcgtatttcgtctg
gctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttggtgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggct
ggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactca
tggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacga
gtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcat
tacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcacttgat
gctcgatgagtttttctaatgagggcccaaatgtaatcacctggctcaccttcgggtgggcctttctgcg
ttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgatgctcaagtcagaggt
ggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgt
tccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagc
tcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccg
ttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatc
gccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttg
aagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtta
cctcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtt
tgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgattttctac</INSDSeq_
sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>543</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..543</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MENIVLLLAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDIL
EKTHNGKLCDLNGVKPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFIRVPEWSYIVERANPANDLCYPGSLNDYEELKH
LLSRINHFEKILIIPKSSWPNHETSLGVSAACPYQGAPSFFRNVVWLIKKNDAYPTIKISYNNTNREDLL
ILWGIHHSNNAEEQTNLYKNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSQVNGQRGRMDFFWTILKPDDAIHFES
NGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSGVEYGHCNTKCQTPVGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNKLVL
ATGLRNSPLREKGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDK
MNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRD
NAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLHHHHHH
HHHH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к созданию штамма рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-Н5, продуцирующей рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8), который индуцирует специфический иммунный ответ против высокопатогенного вируса гриппа A (H5N8). Техническим результатом заявляемого изобретения является рекомбинантная клеточная линия СНО-K1-Н5, продуцирующая рекомбинантный белок гемагглютинин вируса гриппа А (H5N8), который способен индуцировать специфический протективный гуморальный иммунный ответ против вируса гриппа A (H5N8). Проведен дизайн гена rHA/Н5, создана плазмидная ДНК pVL3-HA/H5, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NО: 1 5989 п.н., молекулярный вес 3 700 705 Да, содержащая целевой ген, кодирующий белок-иммуноген НА/Н5 SEQ ID NО: 2. Штамм рекомбинантной клеточной линии СНО-K1-Н5 и рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8), продуцируемый указанным штаммом клеточной линии СНО-K1-Н5 и индуцирующий специфический иммунный ответ против высокопатогенного вируса гриппа A (H5N8). 3 н.п. ф-лы, 8 ил.
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pVL3-HA/H5, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 5989 п.н., молекулярный вес 3 700 705 Да, содержащая целевой ген, кодирующий белок гемагглютинин вируса гриппа А, обеспечивающая экспрессию и секрецию рекомбинантного гемагглютинина с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4 вируса гриппа A (H5N8) в клетках млекопитающих и содержащая в соответствии с физической и генетической картой следующие элементы:
- ori - участок начала репликации, имеющий координаты с 5381по 5968 п.н.;
- энхансер с координатами с 369 по 733 п.н. и промотор CMV с координатами с 734 по 937 п.н.;
- 5'SB и 3'SB - сайты связывания транспозазы SB, имеющие координаты с 88 по 368 п.н. и с 4039 по 4316 п.н. соответственно;
- rHA/Н5 - нуклеотидная последовательность, кодирующая белок гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8) с тримеризующим доменом фибритина бактериофага Т4, имеющая координаты с 1026 по 2657 п.н.;
- EMCV IRES - участок внутренней посадки рибосомы, имеющий координаты с 2733 по 3307 п.н.;
- PuroR - последовательность, кодирующая фактор устойчивости к антибиотику пуромицину, имеющая координаты с 3320 по 3919 п.н.;
- SV40 poly(A) signal - последовательность, необходимая для стабилизации мРНК-транскриптов за счет полиаденилирования, имеющая координаты с 3954 по 4075 п.н.;
- KanR - ген устойчивости к антибиотику канамицину, позволяющий нарабатывать плазмиду в Е. coli и имеющий координаты с 4560 по 5375 п.н.
2. Рекомбинантный штамм клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-Н5, содержащий плазмидную ДНК pVL3-HA/H5 по п. 1 с интегрированной нуклеотидной последовательностью rHA/Н5 и продуцирующий гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8).
3. Рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа A (H5N8), продуцируемый штаммом клеточной линии яичника китайского хомячка СНО-K1-Н5 по п. 2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 и предназначенный для создания профилактических препаратов и серологической диагностики вируса гриппа A (H5N8).
