Способ определения лизосомальной активности лейкоцитов на мазках Советский патент 1991 года по МПК G01N33/49 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для оценки функциональной активности лейкоцитов.

Целью изобретения является повышение точности способа за счет исключения свечения ядер.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут плазму, обогащенную лейкоцитами в концентрации 106 клеток в 1 мл, из отстоявшейся в течение 60-90 мин при температуре 37°С венозной гепаринизирован- ной крови. Далее смешивают взвесь клеток со средой 199 в соотношении 0,05:1 и наносят ее на покровное стекло, помещенное в пластиковую чашку Петри. Инкубируют при 37°С в течение 60 мин чашки Петри, после чего неприлипшие клетки удаляют путем промывания средой 199, на стекле остается только монослой адгезированных клеток. На стекле с монослоем лейкоцитов наносят раствор акридинового оранжевого красителя в среде 199 в конечной концентрации 4,0 мкг/мл и выдерживают препарат 60 мин при

37°С. После инкубации стекло с клетками трижды отмывают от акридинового оранжевого красителя средой 199, а затем помещают на предметное стекло клетками вниз, удалив избыток влаги фильтровальной бумагой. Клетки облучают возбужденным люминесцентным свечением в диапазоне 300-500 нм, используя для этой цели лампу накаливания с йодным циклом КГМ 9-70 и светофильтрами СС-1 и БС-8. Далее осуществляют микрофлюориметрическую регистрацию результатов, для чего применяют ФМЭЛ с интерференционным светофильтром 15, выделяющим возбуждаемое свечение в диапазоне 635-645 нм.

Проводят флюориметрию лизосомаль- ного свечения 100 клеток, результат записывают с помощью самописца Н-3010-1. Определяют средний показатель свечения лизосом одного лейкоцита. При значениях средней активности лизосом меньше 1,77± . ±0,46В определяют снижение лизосомальной активности лейкоцитов, а при значениях этого показателя выше 1,78±0,46 - усиление активности лизосом.

Ј

сь

00

ю

00

Б

Подбор концентраций акридинового оранжевого, а также определенных светофильтров при облучении объекта позволяет исключить полностью свечение ядер, что улучшает люминесценцию лизосом в цитоп- лазме, делает более чистым фон, позволяет исключить побочное свечение.

Пример 1. Из крови получали плазму. Брали плазму с клетками в концентрации 10 /мл из отстоявшейся в течение 60 мин венозной гепаринизированной крови. Далее готовили монослой клеток на покровном стекле в соответствии с общепринятой методикой. Инкубировали монослой в среде 199, содержащей акридиновый оранжевый в конечной концентрации 4,0 мкг/мл в течение 60 мин. Трижды промытое стекло с клетками помещают на предметное стекло и удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой,

Готовый препарат исследуют при люминесцентной микроскопии.

Получили следующие значения лизосо- мальной активности у донора А, они равны 1,69 в, что свидетельствует о нормальной

лизосомальной активности лейкоцитов у данного человека.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить точные результаты о ли зосомальной активности лейкоцитом. Снижение побочного свечения в клетках также создает чистый фон вокруг лизосом, что позволяет исключить потери в активности при ее количественном учете.

Формула изобретения Способ определения лизосомальной активности лейкоцитов на мазках путем их окрашивания раствором акридинового оранжевого с последующим облучением и оценкой активности по величине возбужденного свечения, отличающийся тем, что, с целью повышения точности- способа за счет исключения свечения ядер, окрашивание проводят акридиновым оранжевым в концентрации 3,8-4 мкг/мл в течение 60-90 мин при температуре 37°С, а облучение проводят ультрафиолетовым светом в диапазоне 300-500 нм, при этом активность определяют при возбужденном свечении в диапазоне 635-645 нм.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии. Целью является повышение точности способа за счет исключения побочного свечения ядер. Цель достигается тем, что при окрашивании применяют акридиновый оранжевый в концентрации 3,8-4 мкг/мл, при этом красят в течение 60- 90 мин при температуре 37°С. Облучение препаратов проводят ультрафиолетовым светом в диапазоне 300-500 нм, при этом активность определяют при возбуждающем свечении в диапазоне 635-645 нм. Способ позволяет значительно повысить точность определения лизосомальной активности в лейкоцитах за счет исключения побочного свечения ядерного вещества.