Способ определения активности С @ /М @ -зависимой эндонуклеазы лимфоцитов Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к аналитической биохимии, в частности для выявлений изменения активности Ca/Mg- зависимой эндонуклеазы при диагностике хронического лимфолейкоза крупного рогатого скота.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

Способ состоит в выделении лимфоцитов посредством пропускания крови через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом, выделении клеточных ядер из лимфоцитов, инкубации выделенных клеточных ядер при рН 8,0-8,3 в течение 3-4 ч, экстракции из них ДНК, ее электрофореза в горизонталь}п 1Х блоках агарозных гелей с двумя параллельными рядами, колодцев и определении активности фермента по изменению профиля пика субстрактной ДНК.

Пример. Стабилизированную кровь, содержащую гепарин (Юед/мин), в количестве 50 мл от одного животного пропускают через термостатированную колонку по типу прямого холодильника (высота колонки 200 мм, внутренний диаметр 25 мм) с 0,5 г хлопкового волокна марки 9647-И при 37°С.

I

Элюат, содержащий в основном лимфоциты и эритроциты, подвергают гемоч лизу. Для этого к 50 мл элюата на холоде добавляют 150 мл ледяного раствора 0,83% хлористого аммония и через 1-2 мин инкубации на ледяной бане центрифугируют при 400g, 20 мин при 4 С. Остаток лимфоцитов дважды промывают в 50 мл среды Хенкса. Выел

4

сл

ход лимфоцитов в конечном препарате составляет более 90% клеток.

Лимфоциты гемогенияируют в 10 мл среды ТМС-0,9 (30 ммоль трис-НС1 , рН 8,0; 3 ммоль MgCl 5; 0,9 моль сахарозы, 0,002%-ный тритон Х-100 в количестве 0,002%) в гомогенизаторе Звельхейма-Поттера. Полученный го- могенат наслаивают на раствор ТМС-1,2 (30 ммоль трис-НС1, рН 8,0; 3 ммоль 1,2 моль сахарозы) в соотношении 1:3 и центрифугируют 10 мин, 1500-2000 g при 4°С.

Осадки ядер суспендируют в мини- мальмом объеме ТМС-0,9 без тритона Х-100, затем доводят объем ТМС-0,9 до Ш-12 мл и суспензию центрифугируют 1500-2000gпри 4°С 10 мин.Осадки по данным световой микроскопии пред- ставляют собой интактные клеточные ядра, свободные от цитоплазматичес- ких загрязнений. Выход ядер 0,3 мг ДНК/108 лимфоцитов.

Для определения активности Ca/Mg- зависимой эндонуклеазы клеточные ядра суспендируют в инкубационной среде ТМСС (50 ммоль трис-HCl, рН 8,3; 10 ммоль MgCl-2; 1 ммоль СаС1; 0,25 моль сахарозы) до концентрации 1 мг/мл по ДНК. В инкубационные пробирки ()ппендорф) вносят 10-50 мкл суспензии ядер в ТМСС. Инкубацию проводят при 37 С в течение 4 ч на тер- мостатируемом шейкере. По окончании инкубации в каждую пробу вносят рав- ный объем 2 М NaCl и 0,1 объема 10%- ного додецилсульфата натрия, после чего добавляют протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл и ин- кубируют 30 мин для протеолиза и освобождения ДНК из ДНК - белковых комплексов. После этого к пробам добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1) и встряхивают 20 мин на шейкере. Пробы центрифугируют при 3000 g 10-15 мин, переносят водную (верхнюю) фазу, со- держащую ДНК, в чистые микропробирки после чего к образцам добавляют .1,5 объема 50%-ного глицерина, содержащего 2,5% бромфр-нолового синего. Для проведения электрофореза ДНК го- товят горизонтальные блоки агарозы (2%) в стандартном трис-ацетатном буфере. Размер блоков 17(20-24) см. В блоках Нормируют два ряда гнезд, для чего вставпяют в форму параллельно друг другу на расстоянии 10 см

Q Q $

5

5

гребенки с 20-25 зубчиками, в каждый канал вносят пробы, содержащие 5 мкг ДНК. Электрофорез проводят при напряжении 150 В и максимальном токе в течение одного часа. Гель окрашивают бромистым этидием (1 мкг/мл) и фотографируют, освещая двумя ультра- хемископами с длиной волны 254 нм, расположенными с обеих сторон геля параллельно направлению каналов с углами наклона к поверхности геля 45°.

Полученные негативы сканируют на денситометре Хромоскан-200. Денси- тограммы представляют распределение ДНК, выделенной из клеточных ядер. Пики соответствуют субстратной (хромосомной) ДНК неинкубированных и инкубированных 3 ч ядер. На высоте 2/3 амплитуды измеряют ширину пика (В) и относят ее к 1/3 амплитуды (р). Величину В/Р обозначают как АО для неинкубированных ядер и А для ядер, инкубированных в течение 3 ч. Активность определяют по формуле

. A t АО

А -7 00 .

Ао

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает за 3 ч инкубации клеточных ядер в концентрации 1 мг/мл в среде с 10 ммоль MgCl1, 1 ммоль СаС1 при рН 8,0-8,5 изменение величины А на 0,01 по сравнению с интактными (неинкубированными) ядрами.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить активность CA/Mg-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов крови.

Формула изобретения

Способ определения активности Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов путем выделения из лимфоцитов клеточных ядер в присутствии сахарозы и тритона , инкубации ядер в растворах, содержащих 1 мМ CaClj, 10 мМ MgC.li, экстракции и последующего электрофореза ядерной ДНК в блоках геля агарозы, расчета активности Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов,, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, ядра инкубируют при рН 8,0-8,3 в течение 3-4 ч, а электрофорез ядерной ДНК проводят в горизонтальных блоках гелей агарозы.

Изобретение относится к аналитической биохимии, в частности для выявления снижения активности CA/MG-зависимой эндонуклеазы у животных, больных хроническим лимфолейкозом. Целью изобретения является упрощение, а также повышение чувствительности способа. Лимфоциты периферической крови получают пропусканием образцов через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом. Выделяют клеточные ядра, инкубируют их при рН 8,0-8,3 в течение 3-4 ч в присутствии 10 мМ MGCL₂ и 1 мМ CACL₂, экстрагируют ДНК, разделяют электрофорезом в горизонтальных блоках агарозы и активность фермента рассчитывают по изменению пика субстратной ДНК.