Способ определения состояния В-системы иммунитета Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 G01N33/561 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для выявления активации В-системы иммунитета.

Цель изобретения - повышение точности способа определения состояния В-системы иммунитета.

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты периферической крови выделяют в градиенте плотности фиколл- верографина. Общую популяцию лимфоцитов разделяют на Т- и В-фракции любым из принятых в лаборатории методов розеткоббразования или сепарацией на нейлоновой вате. Полученные В-клет- кй доводят изотоническим раствором хлористого натрия до концентрации I lO в 1 мл. Клетки разрушают по методу, принятому в лаборатории, например замораживанием - оттаиванием. Для разделения изоэнзимов лактатдегид-. рогеназы (ЛДГ) в В-клетках используют метод энзимов электрофореза в поли- акриламидном геле. Активность изоэнзимов ЛДГ оценивают денситометрически, После чего высчитывают коэффициент соотношения величин активности ДЦГ j- (К) путем деления величины активности ЛДГ, на величину активности .

Пример . Донор А. проиммуни- зирован к резус-антигену, титр резус- антител 1:512. Из локтевой вены взято 20 мл крови на консерванте.

Кровь осторожно наслаивают на смесь фиколл-верографин и центрифугируют 30 мин при 1500 об/мин. Образо3-1А6

вавшееся кольцо лимфоцитов осторожно собирают пипеткой в центрифужную пробирку и отмывают дважды раствором Хэнкса по 10 мин при 1500 об/мин. - Осадок лимфоцитов ресуспендируют в среде 199, содержащей 5% инактивиро- ванной телячьей сыворотки, доводя концентрацию лимфоцитов до 8 - () 10 в 1 мл. Количество лимфоцитов определяют путем подсчета под микроскопом в камере Горяева. Разделение лимфоцитов на Т- и В-популяцию проводят на колонках с нейлоновой ватой. В-лимфоциты разрушают путем 10-крат- кого замораживания (-20°С) и оттаивания (18-20 с).

Электрофорез изоферментов ЛДГ в полиакриламидном геле проводят на аппарате для вертрпсапьного гель-элек- трофореза. Исследуемую взвесь разру-. шенных лимфоцитов в количестве

0,1 мл наносят в трубочки, заполненные гелем. Сверху осторожно наслаивают трис-буфер, трубочки закрепляют в катодной камере аппарата. В катодную и анодную камеры заливают по 1 л трис-буфера (рН 8,3). Продолжительность электрофореза 2 ч в холо- - дильнике (4-8°С). Извлечение геля проводят .в кювете с водой под давлением из шприца. Гель промывают водой, помещают в пробирки и заливают краской, прогретой до 37°С.

Состав краски: Li - лактат (288 мг в 3 мл ), НАД (45 г в 1,5 мл ), NaCi (0,1 М - 3 мл), MgCli (0,1 М - 3 мл), фосфатный буфер (рН 7,4-7,5), нитротетразолевый синий (15 мг в 4 мл ) и непосредственно перед заливкой добавляют ФМС (феназинметасульфат) (1%-ныл раствор - 0,75 мл). Пробирки ставят в термостат и выдерживают для

0

5

0

5 0

15 -4

развития окраски в течение 1 ч при 37 С. После окрашивания изоферментных фракций гель промывают водой и заливают 7%-ным раствором уксусной кислоты. Активность изоферментных фракций определяют денситометрически. У донора А, величина активности ЛДГ,30,85%, ЛДГа 12,77%, ЛДГз 46,81%, Д1и 5, 32%, ЩГ 4,26%. Высчитывают коэффициент соотношения ЛДГ,: , кото- .рый составил 7,24. У здоровых лиц Хс равен 1,01+0,44, Следовательно, согласно предлагаемому способу у донора выявлена активация В-системы иммунитета.

Положительнь1й эффект предлагаемо го способа состоит в обеспечении большей точности в выявлении активации В-системы иммунитета по сравнению с известным, поскольку увеличение активности одной из фракций изофермента свидетельствует об активации В-системы иммунитета, хотя общая активность ЛДГ остается без изменений.

Формула изобретения

Способ определения состояния В-системы иммунитета путем выявления активности лактатдегидрогеназы В-лим- фоцитов, о тличающийся тем, что, с целью повьшения точности способа, с помощью электрофореза выявляют активность изоферментов лактат- дегидрогеназы ЛДГ,, ДЦГ, ЛДГз, ДДГ-г и ЛДГд, далее устанавливают соотношение между показателями, максимально различающимися по электрофоретический подвижности, и при значении коэффи-; циента 1,45 и выше определяют активированное состояние В-системы иммунитета.

Изобретение относится к иммунологическим методам исследования и может быть использовано для выявления активации В-системы иммунитета. Цель изобретения - повьпление точности способа. Для оценки состояния В-системы иммунитета определяют изоэнзимный спектр лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в В-лимфоцитах периферической крови и по коэффициенту соотношения величин активности ЛДГ,: ЛДГ, (Кс) судят о состоянии В-системы. Значение коэффициента выше 1,45 свидетельствует об активации- В-системы иммунитета. Положительный эффект предлагаемого способа заключается в его большей точности по сравнению с известным, используя который, не всегда удается выявить активацию В-системы, т.к. противоположная направленность изменений активности изоэнзимов может не привести к изменениям общей активности лактатдегидрогеназы. с $ (Л

Редактор Н.Тупица

Составитель М.Губарев

Техред И. Be рее- Корректор Л. Пилипенко

Заказ S192/43

Тираж 788

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное