Способ определения функционально-активных лейкоцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного делают ополаскивающий смыв 5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают. Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку. Жидкость изо рта сливают медленно, так, чтобы не образовалась пена. Слюну не собирают в пробирку. В полученный смыв (примерно 4-5 мл) добавляют 0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного оседания клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а клетки (лейкоциты) в осадке исследуют хеми- алюминисцентным методом, Люминол 10-3 М готовят следующим образом: навеску 10 мг сухого люминола фирмы Серва суспендируют в 1 мл физраствора и подогревают до 45-50°С. Нерастворившийся люминол отделяют фильтрованием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде. При измерении хемилюминесценции лейкоцитов в присутствии люминола записывают показания в mv с дисплея прибора наибольшую цифру из трех, возникающих каждые 1-2 сек. Функциональную активность лейкоцитов полости рта изучают в присутствии стимулятора пи- рогенала. Для этого в 3 кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогена- ла (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль). Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминола и оставляют на 45 мин при 37°С. Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют хемилю- минесценцию на приборе ЛКБ-1250 (Финляндия). Интенсивность хемилюминесценции определяют как светосумму в mv трех измерений. Коэффициент активации лейкоцитов

сл

С

о

00

о

СО

сл сл

(К) полости рта в присутствии пирогенала рассчитывают по следующей формуле:

v а -Ь

а

где а - светосумма хемилюминисценции нейрофилов в присутствии пирогенала;

b - то же самое без такового.

Пример осуществления способа.

Исследование функциональной активности лейкоцитов полости рта у больного Е-ва, 46 лет с диагнозом верхушечного периодонтита.

У больного делают ополаскивающий смыв 5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают. Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку. Жидкость изо рта сливают медленно, так, чтобы не образовывалась пена. Слюну не собирают в пробирку. В полученный смыв 5 мл добавляют 0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного соединения клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а клетки (лейкоциты) в осадке исследуют хемилюминесцентным методом. Люминол 103М готовят следующим образом: навеску 10 мг сухого люмино- ла фирмы Серва суспендируют в 1 мл физраствора и подогревают до 45 -50°С. Нерастворившийся люминол отделяютфильтро ванием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде. При измерении хеми- люминесценции (ХЛ) лейкоцитов в присутствии люминола записывают показатели в mv с дисплея прибора наибольшую цифру из трех, возникающих каждые 1-2 с. Функциональную активность лейкоцитов полости рта изучают в присутствии стимулятора пирогенала. Для этого вЗ кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогенала (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль). Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминола и оставляют на 45 мин при 37°С. Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют ХЛ на приборе ЛКВ-

1250 (Финляндия). Интенсивность ХЛ определяют как светосумму в mv трех измерений. Коэффициент активации лейкоцитов (К) полости рта в присутствии пирогенала рассчиты5 вают по следующей формуле;К (а-Ь):а, где а - светосумма ХЛ нейтрофилов в присутствии пирогенала; b - то же самое, без такового. В норме коэффициент активации составляет 0,20 - 0,30. При наличии заболевания способ10 ность нейтрофилов к стимуляции низкая (К 0,2). Количество лейкоцитов в пробе составило 10 /мл. Результаты отражены в таблице. Из таблицы видно, что предлагаемый способ позволяет выявить восстановление

15 функциональной активности лейкоцитов полости рта после лечения (до лечения эта активность была снижена, К равен 0,06 и 0,24 соответственно). По известному способу не удалось выявить какие-либо функциональные

20 изменения в лейкоцитах как до, так и после лечения. Объясняется это тем, что в пробе находилось количество лейкоцитов менее 106/мл,

Таким образом, повышение чувствитель25 ности способа делает возможным определение окислительно-восстановительных свойств лейкоцитов в концентрации 10 /мл. В известном способе для такого определения необходима концентрация клеток не 30 менее 106/мл.

Формула изобретения Способ определения функционально-активных лейкоцитов путем выявления окисли35 тельно-восстановигёльной способности их хемилюминесцентньгм методом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, интенсивность хемилюми- несценции лейкоцитов измеряют в смыве с

40 полости рта, который смешивают с 10-кратной средой 199, выдерживают при4°Сдо полного осаждения клеточной фракции, добавляют к ней люминол в концентрации 10 J М, в опытную пробу до введения люминола

45 дополнительно вводят пирогенал в конечной концентрации 25 МПД/мл и по разнице хеми- люминесценции до и после введения пирогенала определяют показатель функционально активных лейкоцитов.

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано с целью диагностики нарушений иммунитета в стоматологии. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Способ осуществляется посредством определения окислительно-восстановительных свойств нейтрофилов хемилюминесцентным методом в смывах с полости рта, которые смешивают со средой 199 в соотношении 10 : 1 и выдерживают при +4°С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют люминол в конечной концентрации 10 3 М и пирогенал (25 МПД/мл). Таким образом повышают чувствительность способа, что позволяет определять функциональную активность нейтрофилов в концентрации 10 клеток/мл 1 табл