Способ определения индивидуальной чувствительности к бета-адреноблокаторам у больных артериальными гипертензиями Советский патент 1991 года по МПК G01N33/66 

Изобретение относится к медицине, преимущественно к кардиологии, и найдет применение в выборе тактики лечения и вторичной профилактике артериальных гипер- тензий.

Целью изобретения является повышение точности и информативности к назначению бета-адреноблокирующих препаратов у больных артериальными гипертензиями

Способ осуществляется следующим образом.

12 мл венозной крови берут в пластиковые пробирки с 3,0 мл 3%-ного раствора ЭДТА (натриевая соль этилендиаминтетра- уксусной кислоты), используемой в качестве антикаогулянта. Лимфоциты выделяют по

методу Bo yum д в фиколл-верографиновом градиенте плотности (р 1,077 t 0,001) и разводят в 5,0 мл 2.7%-ного раствора ЭДТА для подавления агрегации кле-ок Количество клеток в суспензии должно быть не менее 1x10 кл/мл Клетки считают на электронном счетчике, например, типа Picoscale (ВНР)

В полученной суспензии лимфоцитов производят определение циклического аде- нозинмонофосфата (цАМФ), показателя ферментативного звена гликогенолиза - общей гликогенолитической активности и одного из конечных продуктов распада гликогена - редуцированных Сахаров до и после специфической стимуляции клеточо

00 Os Сл VI СП

ных адренорецепторов бета-адреноагони- стом - алупентом. Полученные лимфоциты инкубируют с алупентом в конечной концентрации М при 37°С в течение 10 мин. Суспензию клеток делят на две парные части: в первую серию пробирок (контроль и опыт) вносят по 0,5 мл для определения динамики цАМФ; во вторую серию - по 1,5 мл для определения редуцированных Сахаров и общей (суммарной) гликогенолитиче- ской активности. Алупент добавляют в опытные пробы в количестве, равном половине взятого объема клеток, 0,25 и 0,7 мл соответственно. В контрольные пробы добавляют эквивалентные количества физиологического раствора в той же конечной концентрации.

После инкубации первую серию пробирок центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин для получения осадка клеток, в остальных пробах проводят лимфоцито- лиз путем замораживания при 20°С и последующего оттаивания при комнатной температуре.

В осадке лимфоцитов (первая серия пробирок) производят определение динамики изменения цАМФ: к осадку клеток контрольной и опытной проб добавляют по 0,5 мл 10%-ного трихлоруксусной кислоты, выдерживают при 4°С в течение 10 мин. затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин для осаждения лизированных мембран и надосадочную жидкость сливают в пластиковые пробирки. При необходимости длительного хранения пробы замораживают при -18°С. Определение цАМФ проводят радиоиммунным методом с помощью наборов для радиоиммунного исследования, например, типа Хемапол (ЧСФР). Счет осуществляют на гамма-счетчике, например, Минигамма. Расчет циклических нук- леотидов производят в пикамолях на 107 клеток. Прирост цАМФ вычисляют по формуле и выражают в процентах:

Коп. KKQH.

кон.

X 100 %

где Коп. - концентрация цАМФ в опытной пробе; Ккон - концентрация цАМФ в контрольной пробе.

В полученном гомолизате интактных и стимулированных лимфоцитов определяют динамику содержания редуцированных са- харов как одного из конечных продуктов распада гликогена после кратковременного воздействия агониста на бета-адреноре- цепторы лимфоцитов и суммарную гликоге- нолитическую активность.

Определение редуцированных Сахаров:

В две пробирки (контроль и опыт) вносят по 0.1 мл гемолизата интактных и стимулированных лимфоцитов соответственно, в третью пробирку (контроль на реактивы) 1,0 мл дистиллированной воды. Во все пробирки доставляют по 2,0 мл 0,45%-раствора углекислого кальция, по 0.5 мл 0,1 %-раство- ра NaOH и ставят на 3 мин на кипящую водяную баню. После этого, охладив, центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, сливают надосадочную жидкость в другие пробирки, добавляют по 2,0 мл 0,1%-ного раствора КзРе(СМ)б), приготовленного на 0,7%-ном растворе углекислого кальция, и

ставят на 20 мин на кипящую водяную баню. После охлаждения быстро добавляют по 3,0 мл 1%-ного раствора ЭДТА, встряхивают и колориметрируют при 400-413 нм против дистиллированной воды.

Содержание редуцированных Сахаров

рассчитывают по формуле

x 100 %

CK tCT

где Ек оптическая плотность контрольной

пробы; Ех - оптическая плотность исследуемой пробы: ECI - оптическая плотность стандарта.

Результаты выражают в мкмоль /10 лимфоцитов, для чего полученный результат

(в гаммах) делят на молекулярный вес глюкозы (180,0) и количество клеток во взятом для исследования объеме,

Определение суммарной гликогеноли- тической активности (СГА).

В четыре пробирки (Ik. lo. Ik1, lo1) вносят

по 0,25 мл гемолизата лимфоцитов; причем в Ik, lo из интактных клеток, в Ik . lo1 из клеток, стимулированных алупентом. В опытные пробы (10, lo ) добавляют по 0,75 мл

(до 1,0 мл) 0,5%-ный раствор гликогена и ставят на 30 мин на водяную баню при 37°С с постоянным перемешиванием. После этого во все пробы добавляют по 2,0 мл 0,45%- ного раствора сульфата меди, по 0,5 мл 0,1

н, раствора NaOH, а в контрольные пробы (Ik, Ik1) no 0,75 мл 0,5%-ного раствора гликогена. Затем ход определения повторяет таковой для редуцированных Сахаров. Расчет СГА ведут следующим образом.

50

- v 4 е°1Х| |°-( - L «

c,,(ll- L ™-i -4) ™

СГА выражают в мкмоль/107 кл х мин.

По величине прироста редуцированных Сахаров более,чем на 200% активации СГА более, чем на 100%, приросту цАМФ более, чем на 10%, делают заключение о повышенной функциональной активности бета-адренорецепторов, что является показанием для назначения бета-адреноблокирующих препаратов. Данные изучения эдренозависи- мых процессов в лимфоцитах здоровых людей (доноров) не выявили существенных изменений в функциональном состоянии клеточных адренорецепторов, т.е. показатели биохимических сдвигов в ответ на специфическую стимуляцию оказались у них ниже вышеуказанных пределов.

П ример 1. Больной Б.,48 лет,страдает артериальной гипертензией в течение 12 лет. После полного клинико-инструменталь- ного обследования установлен диагноза гипертоническая болезнь II стадии, медленно прогрессирующее течение. После проведе- ния медикаментозных проб с гипотензивными препаратами у больного выявлен бета-адренозависимый вариант артериальной гипертензии: прием 40 мг обзидана вызывал значительное снижение артери- ального давления (186/110-160/100 мм рт. ст. - 14%). В лимфоцитах больного отмечалась следующая динамика биохимических процессов (см. табл.1)

Прирост цАМФ на 53%, PC - на 217%, СГА - на 192% свидетельствовал об активации бета-адренорецепторов у данного больного. Назначение Обзидана в дозе 160 мг/сут привело к стойкому снижению артериального давления в течение 2 недель(до 146/92 мм рт.ст.).

Пример 2. Больная С., 54 года, в течение 11 лет страдает хроническим пиелонефритом с артериальной гипертензией. Проба с Обзиданом не привела к сущест- венному снижению артериального давления (до пробы - 182/100, после - 176/106 мм рт.ст.). Динамика биохимических процессов в лимфоцитах больной также не выявила значительных сдвигов по сравнению с контрольной группой (см. табл.2).

Эти данные свидетельствуют о том, что у больной отсутствует гиперадренореактив- ность бета-адренорецепторного аппарата, что позволяет прогнозировать неэффектив- ность бета-адреноблокаторов у этой больной. Гипотензивный эффект наблюдался в ответ на прием альфа-адреноблокатора Пир- роксана, назначенного в дозе 0,03 г/сут.

Преимущество предлагаемого способа продемонстрировано в табл.3, в которой приводятся данные исследования больных артериальными гипертензиями с использованием известного и предлагаемого способов.

Таким образом, по сравнению с известными, предлагаемый способ обладает следующими преимуществами:

он более точен и информативен, так как позволяет определять активность непосредственно клеточных адренорецепторов, т.е. тех структур, на которые воздействуют адреноблокаторы:

он достаточно прост в исполнении с использованием доступных биохимических методов.что легко осуществимо в клинической практике;

способ обладает высокой специфичностью, поскольку для стимуляции лимфоцитов используется специфический агонист бета-адренорецепторов - орципрералин (алупент), а изучаемые при этом биохимические процессы (гликогенолиз, циклические нуклеотиды) являются строго адренозависи- мыми.

Формула изобретения

Способ определения индивидуальной чувствительности к бета-адреноблокаторэм у больных артериальными гипертензиями путем клинического исследования, о т л и ч- а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности и информативности способа, в лимфоцитах периферической крови определяют концентрацию Сахаров, цАМФ, суммарную гликогенолитическую активность до и после введения специфического бета-ад- реноагониста - алупента и при повышении концентрации Сахаров на 200% и выше. цАМФ на 10% и выше, суммарной гликоге- нолитической активности на 100% и выше прогнозируют индивидуальную чувствительность к бета-ад реноблока юрам у больных артериальными гипертензиями.

Т а б л и ц а 1

Т а бл ица 2

Изобретение относится к медицине, преимущественно к кардиологии, и найдет применение в выборе тактики лечения и вторичной профилактике артериальных гипер- тензий Целью изобретения является повышение точности и информативности к назначению бета-эдреноблокирующих препаратов у больных артериальными гипер- тензиями Для этого в лимфоцитах периферической крови определяют концентрацию Сахаров, цАМФ, суммарную глико- генолитическую активность до и после введения специфического бета-адреноаго- ниста алупента и при повышении Сахаров на 200% и выше, цАМФ на 10% и выше, суммарной гликогенолитической активности на 100% и выше прогнозируют индивидуальную чувствительность и бета- адреноблокаторам у больных артериальными гипертензиями со С

Таблиц 3 нстичсскк обработайте данные исследования больных артериальными гнпергенэнями с использованием