со
с
Изобретение относится к вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину. У больных с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДу комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РН-азы L. У таких пациентов функциональные 2-5А не способны активировать РН-азу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дзРНК, активирует 2-5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2- 5А. Установлено, что наличие ингибитора РНК-азы является маркером присутствия СПИД, СЗЛ или РСК. 1 табл.
Изобретение относится к области вирусологии, в частности к способу обнаружения вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину.
Открыто ингибирующее вещество, выделяющееся или понуждаемое к выделению клетками, инфицированными вирусами иммунодефицита человека. Этот ингибитор, видимо, физически связан с ферментом РН- азой L - конечным продуктом в системе 2, 5 -олигоаденилят-РН-аза L, и приводит к выходу из строя всей иммунной системы, что позволяет вирусам бесконтрольно мультиплицироваться. Описаны методики идентификации таких ингибиторов либо непосредственно, либо косвенно по отсутствию РН-азы L или неактивности РН-азы L, либо по присутствию промежуточных биохимических веществ в системе 2 -5 А-РН-аза
L, при этом ингибитор служит маркером для обнаружения присутствия HIV или родственных вирусов, дающих по существу аналогичную клиническую картину.
Обсуждается также прогнозирующее значение такого маркера с точки зрения развития СПИДа в полном расцвете у больных, в частности у больных, имеющих антитела к HIV в периферийной крови и тканях, в том числе крови, фракциях крови, клетках трансплантированных органов и клеточных экстрактах. Описаны способы активации РН-азы L или дезактивации ингибирующего РН-азу L вещества. Частью предлагаемого изобретения являются лечебные методы борьбы со СПИДом и родственными вирусами и контроля развития таких вирусов путем активации РН-азы L и/или удаления, или дезактивации ингибирующего РН-азу L вещества (веществ),или направленного на инО 00 VI
о
00
ел
СА
гибиторы вируса. В предлагаемое изобретение включены способы получения антител к указанным вирусам как in vivo, так и in vitro, использованием в качестве антигена специфичного ингибитора РН-азы L или направляемых вирусом ингибиторов биохимических промежуточных веществ в системе 2 -5А -РН- аза L.
В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови (МКПК) людей с синдромом заболевания лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДу комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), замерены компоненты системы 2-5А-синтетаза-РН-аза L. Уровень 2-5А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находится на базаль- ном уровне у больных РСКом или СЗЛом. Однако, вне зависимости от колебаний концентрации 2-5А-синтетазы (2-5А) высокие эндогенные концентрации 2-5А (до 35 нМ) обнаружены у больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Экстракты 2-5А наделе оказались функциональными, о чем свидетельствуют испытания на связывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с ядро-целлюлозой. Несмотря на повышенные концентрации эндогенной функциональной 2-5А, ни для одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть показана активированная РН-аза L. Однако у всех здоровых людей РН-аза L в МКПК была активирована, даже несмотря на то, что концентрации эндогенной 2-5А составляли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свидетельствуют о присутствии ингибитора РН- азы L у пяти больных СЗЛом. РСКом и СПИДом. Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируемому 2-5А специфичному для рН-азы L разрушению рРНК в экстрактах клеток L929. Один из таких ингибиторов РН-азы „L осаждается трихлоруксусной кислотой (ТХК) и этанолом. Ингибирование действия РН- азы L снимается обработкой РН-азой А или протеазой. Исследования предполагают, что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом эндогенная дзРНК активирует 2- 5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А. Способности функциональных 2-5А активировать РН- азы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом.
Определение концентрации 2-5А и функционирования РН-азы L в экстрактах МКПК с использованием специфичных и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 2- 5А-синтетаза-РН-аза L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом заключается в
присутствии ингибитора РН-азы L, но не в синтезе нефункциональных 2-5А. Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиеся парадоксальными взаимодействия,
происходящие в инфицированной вирусом клетке, могут быть теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями.
Связанную с акриловыми шариками (1
0 мг) РН-азу А или связанную с карбоксиме- тилцеллюлозой (1 мг) (Sigma chemical Co) вымачивают в NP40 лизисном буфере (16) (10 мкл) 2 ч при 30°С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание)
5 до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30°С. Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз пе- ремешивают, Контрольные образцы
0 инкубируют без всякого добавления фермента. Иммобилизованные ферменты осаждают центрифугированием (lOOOOx g, 5 мин, комнатная температура). Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к
5 экстрактам клеток L929 (150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для РН-азы L активности.
Выделенные из экстрактов МКПК эндо0 генные 2-5А данные характеризуют проведением испытаний по расцеплению рРНК. Образованные при расщеплении РН-азой L продукты с выделенными из МКПК 2-5А значительно отличаются в экстрактах клеток
5 L929 от продуктов, полученных с аутентичными 2-5А. Например, эндогенные 2-5А, выделенные из МКПК, активируют РН-азу L из клеток L929 с расщеплением 28S и 18S рРНК и образованием трех специфичных
0 продуктов расщепления. Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2-5А, синтезируемые в МКПК, отличаются от аутентичных 2-5А.
5 Для выявления уровня свободной (не-2- 5А-активированной) РН-азы L, являющейся целевым ферментом для 2-5А, использовано испытаннее радиосвязыванием. Могут быть также использованы и другие целевые фер0 менты. В экстрактах МКПК больных СЭЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РН- азы L в 5-7 раз выше, чем у здоровых людей. Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образ5 цов, в которых эндогенные 2-5А конкурируют с Р/рСр за связывание с РН-азой L. Соответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень РН-азы L Таким образом, сущест- венно определение уровня 2-5А-активированной РН-азы L. Для достижения этого использован новый чувствительный метод, позволяющий определять активированную РН-азу 1.0 экстрактах МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специфичности расщепления 2-5А-активированной РН- азы на рРНК.
Вследствие того, что рРНК присутствует в МКПК ниже урооня детектирования, экстракты клеток HL 929 (субклон штамма клеток L 929 с дефицитом РН-азы L) используют в качестве источника рРНК. Использованием этого метода удалось показать, что РН-аза L неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, где имеет место высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2-5А. Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали при- сутствие активной РН-азы L, дающей специфичные продукты расщепления несмотря на то, что 2-5А присутствует в концентрации L 5нМ.
В экстрактах МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2-5А. Почему же неактивна РН-аза L -Для определения того, является ли отсутствие активности РН- азы L следствием нефункциональности РН- азы L или следствием присутствия ингибитора активности РН-азы L, проведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток L929, содержащие функциональную РН-азу, смешивают и совмест- но инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Специфичных продуктов расщепления для РН-азы L не обнаружено.
Эндогенные 2-5А, ответственные за ак- тивацию РН-азы L, дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых эти образцы происходят. Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК инги- битора (ингибиторов) РН-азы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор не обнаружен у здоровых людей. поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные для РН-азы L продукты рас- щепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток L929. Точно так же растворимая фракция ТХК МКПК от здорового человека генерирует специфичные продукты распада. Присутствие функцио- нальных 2-5А и тот факт, что предполагаемый ингибитор РН-азы L осаждается ТХК и этанолом, наводит на мысль о том, что ингибитор РН-азы L не является аналогом 2-5А. как недавно идентифицировалось в клеточных культурах, инфицированных HSV-1 и ре- тровирусом.
Опыты с использованием разрушающих ферментов, иммобилизованных на твердых носителях, дают совершенно новое представление о природе ингибитора (ингибиторов) РН-азы L, найденных в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Если экстракты МКПК больных СПИДом предварительно инкубируют с иммобизиро- ванной протеазой или РН-азой А и затем совместно инкубируют с экстрактами клеток L929, активность РН-азы L восстанавливается, о чем свидетельствует появление специфичных продуктов расщепления.
Настоящие исследования показывают, что дефект в противовирусной системе 2-5А- синтетаза-РН-аза L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом может быть отнесен за счет ингибитора РН-азы L, а нее за счет отсутствия функциональных 2-5А. Ингибитор РН-азы L присутствует в экстрактах МКПК больных СЗЛом. РСКом и СПИДом, что указывает на возможность существования ингибитора на всех стадиях развития типичных ретровирусных заболеваний и что этот ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирусным) патогенным инфекциям. С учетом того, что во всех случаях МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом, подвергшихся испытанию, содержат РНК HIV (определено молекулярной гибридизацией) и центры инфицирования HIV (определено совместным культивированием лимфоцитов), вполне вероятно, что ингибитор РН-азы L индуцируется вирусом.
Репликация вируса модифицирует систему 2-5А-синтетаза-РН-аза L таким образом, что естественное противовирусное состояние не может быть в полной мере экспрессировано или отрегулировано. Вполне вероятно, что белок (и), и РНК (ы), закодированные HIV или другим сосуществующим с ним ретровирусом, могут ингиби- ровать активацию РН-азы L.
Пример. Моноядерные клетки периферийной крови (МКПК) выделяют на Ficoll- Hypagua. клетки L929 и HL929 (субклон L929 с дефицитом РН-азы L) получают в культуре с монослоем, цитоплазматические экстракты клеток L929 и HL929 получают в глицериновом буфере, экстракты МКПК получают в NP40 лизисном буфере согласно известным методикам.
Концентрация белка в экстрактах 1- 15 мкг/мкл.
Активность 2-5А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг на испытание) использованием поли (1)-поли(С)-агарозы. 2-5А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном-три-н-актилами- ном. Экстрагированные ТХК 2-5А затем ли- офилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизированы в объеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на 1 мкл. Концентрации 2-5А, присутствующие в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязывание с экстрактами клеток L929 в качестве источника РН- азы L. Из 18900 dpm рзА4/32/Р/рСр (удельная активность 3000 С /ммоль, Amersham), добавленных на одно испытание, 19400 dpm связываются и РН-азой в отсутствие 2-5А. Примерно 9-14 рзА4/ /Р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных образцов 2-5А, Концентрацию 2-5А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2-5А, это определение основано на подсчете концентрации ци- топлаэмического белка в 25 мкг/мл. Концентрацию 2-5А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с адроцеллю- лозой с клетками L929 в качестве источника РН-азы L Активация РН-азы L в таком испытании основана на превращении поли (U)/32P/pCp в растворимые в кислоте фрагменты. Примерно 5-20% всего количества поли (U)/ Р/рСр (15000 dpm) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2-5А. Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутеничных 2-5А. Уровень свободной РН-азы L измеряют при испытании на радиосвязывание после добавления 20000 dpm рз/А 1/32Р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание).
Активность 2-5А-синтетазы, концентрация эндогенных 2-5А, уровень свободной РН-азы LH присутствие ингибитора РН-азы L в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом приведены в таблице.
Активность индуцированного интерфероном фермента (2-5А-синтетазы) в экстрактах МКПК, полученных от больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, измеряют In vitro и сравнивают с активностью экстрактов от эдоро- вых людей (таблица). Концентрации 2-5А-синтетазы у больных СПИДом ( 3 и 5) были в 16 и 20 раз выше, чем у нормальных пациентов (таблица). И напротив, концентрации 2-5А-синтетазы у больных СЗЛом (1),
РСКом (Я2) и СПИДом с саркомой Капоши (СК) (4) выше всего лишь в 1,3-5 раз, что подтверждают сделанные другими основные наблюдения.
Для определения того, являются ли такие измерения In vitro 2-5А-синтетазы указанием на функциональность фермента in vivo, из МКПК экстрагируют 2-5А. Биологическую активность 2-5А из растворимых в
ТХК фракций экстрактов МКПК усиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядро-целлюлозой. Концентрации 2-5А аналогичны при испытании двумя методами (таблица). Сходность
результатов, полученных методами А и В (таблица), указывает на то, что 2-5А, выделенные из экстрактов МКПК человека, могут связываться и активизировать РН-азу L из клеток L929 в той же степени, что и аутентичные2-5А.
Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2-5А-синтета- зы 11 эндогенными 2-5А при СЗЛ. РСК и СПИД (таблица) может быть впервые обьяснено следующим образом. Определение 2- 5А-синтетазы в испытаниях In vitro основано на частичной очистке через поли (г)-поли(гС)-агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную
2-5А-синтетазу, а не 2-5А-синтетазу, активированную In vivo с помощью дзРНК. Однако, непосредственно измеряют эндогенную 2- 5А-синтетазу плюс деградируемые 2-5А- ферменты (например, 2 -фосфодиэстераза и
фосфатазы), Таким образом, аккумулирование 2-5А МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградируемых 2-5А-ферментов. Присутствие 2-5А в МКПК также указывает на то, что
существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных СПИДом. Формула изобретения Способ обнаружения присутствия вируса иммунодефицита человека или другого вируса, дающего аналогичную клиническую картину, включающий определение присутствия биологического маркера в пробе биологического материала, отличающийс я тем, что в качестве маркера используют инГИбИТОР РНК-азы L, а в качестве биологического материала используют моноядерные клетки периферической крови.
Примечание.
а - стандартное отклонение 9%;
б - определено в испытании по радиосвязыва-
нию (дублировано); в - определено в испытании с ядро-целлюлозой
(дублировано), стандартное отклонение М«; г - определено в испытании по радиосвязыванию
(дублировано), стандартное отклонение 10%; д - определено в испытании по расщеплению рРИК; е - в среднем для 7 контрольных образцов (дубли-
ровано); НО - не определялось.
