Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека Советский патент 1993 года по МПК A61K39/12 

I СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) представляет собой одну из основных угроз здоровью людей в двадцатом сто, 1етии, Вследствие его изменчивой биологи- чес ой природы, коварных способов распространения от индивидума к индивидуму, скрытого периода развития болезни, что делает затруднительным само ее обнаружение, СП /1Д, несомненно, состоит в ряду эпидемиолог 1ческих проблем, требующих беспрецеден- тних усилий. В самом деле, даже при значительных затратах, вложенных на увеличение надежности диагностики СПИДа, созданные к настоящему времени методики все ещо в недостаточной степени отвечает необходимым требованиям четкого контроля этой проблемы для любой группы населения.

Существуют различные обозначения вируса иммунодефицита человека (HiV), вирус СПИДа, выделенный в Пастеровском Институте (Париж, Франция) обозначают как LAV в то время как вирус, выделенный в Национальном Институте здоровья (Бефез- да шт.Мэриленд, США), обозначают как HTLV-III. В настоящем тексте вирус HIV частот будет называться в его общем значении или же будет обозначаться как HTLV-III, LAV или HIV, но без намерения провести различия между ними. Более того, термин HIV в настоящем описании включает всякие любые другие вирусы, которые могут быть связаны со СПИДом, вне зависимости от того выделены ли они или еще нет. Имеется в виду, что HIV в единственном числе

00

со

О

OJ

включает любой тип HIV, независимо от его геномного содержания. Аналогично, характерные для СПИДа симптомы в общем виде будут называться, как включающие симптомы, вызываемые HIV (согласно вышеприведенному определению), симптомы РСК (родственный СПИДу комплекс), симптомы синдрома заболевания лимфатических узлов (СЗЛ) и симптомы, вызываемые другими вирусами, с по существу аналогичной клинической картиной.

СПИД следует за прогрессирующими нарушениями иммунной системы, вызванные инфекцией вирусом иммунодефицита человека (HIV). На ранних стадиях болезни ответственные за иммунность клетки становятся дефектными вследствие потери Т-кле- ток (происходящих из тимуса клеток), экспрессирующих так называемой Т4-анти- ген, т.е. той части Т-клеток, которая в основ- ном состоит из фага-помощника и индуктора. Дефицит Т4 в клетках может привести к определенным видам дефицита в передающейся с помощью клеток иммунности, втом числе: дефицита ЕУ (естественных клеток-убийц) АЛУ (активированных лимфо- кином клеток-убийц) и цитолитичных Т-клеток.

СПИД, видимо, является прогрессирующей болезнью, хотя время перехода из одной фазы в другую может меняться. Для фаз развития СПИДа существует классификация. Существуют асимптоматические индивидумы, зараженные HIV (серопо- ложительные), о чем судят по циркуляции антител к вирусу. Если у них отсутствуют другие маркеры, их относят к больным на BPI-стадии согласно классификации Вальтера Рида Их также называют предРСК/РСК - родственный СПИДу комплекс, хотя некоторые такие больные могут так никогда и не показать характерных для РСК симптомов. У некоторых таких больных может развиться болезнь лимфатических узлов (ВР2) и появиться дефицит Т4-клеток (ВРЗ). Затем происходит снижение способности лимфоцитов претерпевать стимулируемую антигеном пролиферацию и стимулируемой антигеном способности образовывать гамма-интерферон, и пациенты на такой ВР4-стадии начинают терять замедленную кожную гиперчувствительность. Больные на ВР5-стадии обычно становятся вялыми. Они подвержены заражению опоясывающим лишаем, афтозному стоматиту (молочнице) или имеютсимптомы РСК, которые включают: продолжительные ознобы, потение по ночам, слабость, понос и/или потерю веса. Этот период РСК обычно также характеризуется прогрессирующим снижением иммунности, Наконец, больные на ВРб-стадии подвержены любым инфекциям, т.е. речь идет о СПИДе в полном расцвете, когда 50% больных умирает в

течение 12 месяцев.

Описан направляемый HIV ингибитор- (ы) естественного 2 -5 А противовирусного защитного процесса. Сделанные открытия относятся к новым диагностическим и/или

лечебным способам, направленным на разнообразные вирусные нарушения (напр.: лишаи, инфекции ретровирусами и т.д.) и/или потенциально также на раковые заболевания,

Индуцируемая интерфероном система

2-5А(2 -5 -алигоадениляты)синтетаза-РНа- за L является частью защитного механизма организма против вирусных инфекций. Отдельные элементы такой системы включают:

(|) зависимую от дзРНК 2-5А-синтетазу, (II) эндогенные 2-5А и (III) зависимую от 2-5А эндорибонуклеазу (РНазу L). Дефект в любом из перечисленных элементов системы 2-5А-синтетаза-РНаза L неизбежно приведет к полному или частичному упразднению противовирусного действия системы.

В сыворотке или моноядерных клетках периферийной крови (МКПК) людей с некоторыми вирусными инфекциями или подвергавшихся лечению интерфероном обнаружена повышенния концентрация 2- 5А-синтетазы. Индуцирование 2-5А-синте- тазы в МКПК, таким образом, видимо, может иметь потенциальное, хотя и ограниченное

значение для диагностики. Более того, повышенная концентрация 2-5А-синтетазы в МКПК указывает на запущенное состояние болезни при некоторых вирусных нарушениях, но и напротив является признаком

эффективного лечения интерфероном других вирусных инфекций. Интерферон был найден в сыворотке больных СПИДом, и тем не менее, устойчивое повышение уровня 2- 5А-синтетазы показано для больных на стадни перехода от РСК к СПИДу. Такие громадные лабораторно-клинические несоответствия могут быть объяснены, если считать нефункцинальными другие элементы системы 2-5А-сйнтетаза-РНаза L Для того,

чтобы исследовать такую возможность, необходима характеристика синтетазы 2-5А in vivo и действия РНазы L, о чем подробно говорится ниже.

Фиг.1 представляет собой фотографию

результатов электрофореза на пластинке с полиакриламидным гелем, показывающими активацию РНазы L по действиям 2-5А, экстрагированных МКПК людей, страдающих СЗЛ, РСК и СПИДом, что, установлено в

испытании на расщепление рибосомной РНК.

Фиг.2 представляет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с

олиакриламидным гелем, показывающих |активацию уровня РНазы L в экстрактах VIКПК, что установлено в испытании по расцеплению рибосомной РНК.

Фиг.З представляет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с юлиакриламидным гелем, показывающих юсстановление активности по расщеплению рибосомной РНК и МКПК.

Фиг.4 является диаграммой, иллюстрирующей систему 2 -5 -олигаденилят-РНа- la L

Открыто ингибирующее вещество, выделяющееся или понуждаемое к выделе- нию, клетками, инфицированными вирусами иммунодефицита человека. Этот И нгибитор, видимо, физически связан с фер- |фентом РНазой L - конечным продуктом в системе 2 -5 -олигоаденилят-РНазы L и приводит к выходу из строя всей иммунной системы, что позволяет вирусам бесконт- рольно мультиплицироваться. Описаны ме- Т1эдики идентификации таких ингибиторов л|1бо непосредственно, либо косвенно по отсутствию РНазы неактивности РНазы L, либо по присутствию промежуточных биохимических веществ в системе 2-5- Р Чаза L, при этом ингибитор(ы) служит мар- MipOM для обнаружения присутствия HIV или родственных вирусов, дающих по существу аналогичную клиническую картину.

Также обсуждается прогнозирующее значение такого маркера с точки зрения ргзвития СПИДа в полном расцвете у боль- них, в частности, больных, имеющих антитепа к HIV в периферийной крови и тканях, втом числе, крови, фракциях крови, клетках трансплантированных органов и клеточных экстрактах, Описаны способы активации РНазы L или дезактивации ингибирующего РНазу L вещества. Частью настоящего изобретения являются лечебные методы борьбы со СПИДом и родственными вирусами и ко нтроля развития таких вирусов путем ак- тинации РНазы L и/или удаления или дезак- типации ингибирующего.РНазу L вещества (веществ), или направленного на ингибито

ры

вируса. В настоящее изобретение включеНы способы получения антител к указанным вирусам как in vivo так и in vitro с использованием в качестве антигена спе- 55 циничного ингибитора РНазы L или направля

мых

вирусом

биС химических

промежуточных системе 2 -5А -РНаза L.

ингибиторов веществ в

5

0

5

0 5 0

5

0

5

0

5

В экстрактах моноядерных клеток периферийной крови (МКПК) людей с синдромом заболевания, лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДу комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) замерены компоненты системы 2-5А-синтетаза-РНаза L. Как показано, уровень 2-5А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находится на базальном уровне у больных РСКом или СЗЛом. Однако вне зависимости от колебаний колнцентраций 2-5А-синтетазы (2-5А) высокие эндогенные концентрации 2-5А(до 35 нм) обнаружены у больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Экстракты 2-5А на деле оказались функциональными, о чем свидетельствуют испытания на связывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с ядро-целлюлозой. Несмотря на повышенные концентрации эндогенной функциональной 2-5А, ни для одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть показана активированная РНаза L. Однако у всех здоровых людей РНаза LB МКПК была активирована, даже несмотря на то, что концентрации эндогенной 2-5А составляли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свидетельствуют о присутствии ингибитора РНазы L у пяти больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор может переноситься и может препятствовать индуцируемому 2-5А специфичному для РНазы L разрушению рРН К в экстрактах клеток 1929. Один из таких ингибиторов РНазы L осаждается трихлоруксусной кислотой ) и этанолом. Ингибирование действия РНазы L снимается обработкой РНазой А или про- теазой. Мои исследования предполагают, что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом эндогенная дзРНК активирует 2- 5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А. Способности функциональных 2-5А активировать РНазу L препятствует индуцируемой HIV ингибитор РНазы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом.

Хочу отметить здесь, что определение концентрации 2-5А и функционирования РНазы L в экстрактах МКПК использованием специфических и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 2-5А-синтетаза- РНаза L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом заключается в присутствии ингибитора РНазы L но не в синтезе нефункциональных 2-5А. Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиеся парадоксальными взаимодействия происходящие в инфицированной вирусом клетке могут быть

теперь объяснены рациональными согласованными биохимическими понятиями,

Связанную с акриловыми шариками (1 мг) РНазу А или связанную с карбоксиме- тилцеллюлозой (1 мг) (Sigma Chemical Co, вымачивают в NP40 лизисном буфере (16) (10 мкл) 2 ч при 30°С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30°С. Во время повторного инкубирования содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают. Контрольные образцы инкубируют без всякого добавления фермента. Иммобилизованные ферменты таблетируют центрифугированием (10000 х 0,5 мин, комнатная температура). Пять микролитров центрифугированных фракций добавляют к экстрактам клеток L929 (150 мкг белка на испытание) и проводят испытания по расщеплению рРНК для определения специфичной для РНазы L активности.

Выделенные из экстрактов МКПК эндогенные 2-5А далее характеризуют проведением испытаний по расщеплению рРНК, Образованные при расщеплении РНазой L продукты с выделенными из МКПК2-5А значительно отличаются в экстрактах клеток 1929 от продуктов, полученных с аутентичными 2-5А (фиг.1, сравнить полосы 3, 5, 7 и 9 с полосой 10). Например, эндогенные 2- 5А, выделенные из МКПК, активирует РНазу L из клеток L929 с расщеплением 28S и 18S рРНК и образованием трех специфических продуктов расщепления (фиг.1, полоса 10). Объяснение наблюдаемых различий в продуктах расщепления может заключаться в том, что эндогенные 2-5А, синтезируемые в МКПК, отличаются от аутентичных 2-5А.

Для выявления уровня свободной (не- 2-5А-активированной) РНазы L, являющейся, как в настоящее время установлено, целевым ферментом для 2-5А, использовано испытание с радисвязыванием.Могут быть также использованы и другие целевые ферменты, которые равно уместны в моем открытии. В экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РНазы L в 5-7 раз выше, чем у здоровых людей (табл.1, столбец 4). Однако испытание на радиосвязывание имеет ограниченное значение для образцов, в которых эндогенные 2-5А контактируют с (РзА4/32Р/рСр за связывание с РНазой L. Соответственно, результаты испытаний по радиосвязыванию точно не отражают уровень РНазы L. Таким образом, существенно определение уровня 2-А-активированной РНазы L. Для достижения этого мною использован новый чувствительный метод,

описанный ниже, позволяющий определять активированную РНазу L в экстрактах МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специфичности расщепления 2-5А-активированной РНазы на рРНК. Вследствие того, что рРН К присутствует в МКПК ниже уровня детектирования, экстракты клеток HL929 (субклон штамма кле0 ток L929 с дефицитом РНазы L) используют в качестве источника рРНК, Клетки HL929 депозитированы в Американской Коллекции типовых культур (Роквиль, шт. Мэриленд, США) под регистрационным но5 мером согласно Будапештскому Соглашению. Использованием этого испытания мне удалось показать, что РНаза L неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом (фиг.2, полосы 2-6), где имеет мес0 то высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2-5А. Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихся испытанию, показали присутствие активной РНазы L дающей специфичные

5 продукты расщепления (фиг.2, полоса 7), несмотря на то, что 2-5А присутствует в концентрации 5 нМ (таблица, столбец 2),

Мои наблюдения того, что в экстрактах МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и

0 СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2-5А, подняли вопрос - почему же неактивна РНаза L. Для определения того, что является ли отсутствие активности РНазы Цчто очевидно из фиг.2, полосы 2-6)

5 следствием нефункциональности РНазы L или следствием присутствия ингибитора активности РНазы L проведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток L929, содержащие фукциональную РНазу,

0 смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Специфичных продуктов расщепления для РНазы L не обнаруживается (фиг.1, полосы 3, 5 и 7).

5Важно подчеркнуть, что эндогенные 25А, ответственные за активацию РНазы L (фиг.1, полосы 3, 5 и 7), дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых

0 эти образцы происходят (фиг,1, полосы 2, 4 и 6). Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов) РНазы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор не об5 наружен у здоровых людей, поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные для РНазы L продукты расщепления после совместного инкубирования с экстрактами клеток L929 (фиг.1, полоса 9). Присутствие функциональных 2-5А и тот факт, что предполагаемый ингибитор РНазы L осаждается ТСК и этанолом, наводит на мысль о том, что ингибитор РНазы L не является аналогом 5А, как недавно идентифицировалось в сточных культурах, инфицированных HJSV-I и ретровирусом.

Мои опыты с использованием разруша- ю|щих ферментов, иммобилизованных на ;ердых носителях, дают совершенно новое представление о природе ингибитора (инги- 1торов) РНазы L, найденных в экстрактах КПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. :ли экстракты МКПК больных СПИДом едварительно инкубируют с иммобилизо- нной протеазой или РНазой А и затем вместно инкубируют с экстрактами кле- к L929, активность РНазы L восстанавли- втся, о чем свидетельствует появление специфичных продуктов расщепления (фиг.З, сравнить полосы 1 и 2 с полосой 3).

Мои настоящие исследования показывают, что дефект в противовирусной систе- мф2-5А-синтетаза-РНаза LB МКПК больных , РСКом и СПИДом может быть отне- сен за счет ингибитора РНазы L, а не за счет отсутствия функциональных 2-5А. Ингиби- трр РНазы L присутствует в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, чтр указывает на возможность существования ингибитора на всех стадиях развития ти пичных ретровирусных заболеваний и что этот ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирус- нь м) патогенным инфекциям. С учетом моего предыдущего сообщения о том, что во возх случаях МКПК больных СЗЛом, РСКом ил i СПИДом, подвергшихся испытанию, соде эжит РНК НIV(определено молекулярной ридизацией) и центры инфицирования

ГИ1

HI ни

гифитор РНазы L индуцируется вирусом. Открытия, о которых сообщается здесь,

У) определено совместным культивирова- :м лимфоцитов), вполне вероятно, что инпр

здполагает, что репликация вируса модифидирует систему 2-5А-синтетаза-РНаза L та):им образом, что естественное противовирусное состояние не может быть в полной мере экспрессировано или отрегулировано. Впэлне вероятно, что белок-(и) и РНК-(ы), закодированный HIV или другим сосущест- вующим с ним ретровирусом, может ингиби- РОЕОТЬ активацию РНазы L.

Пример. Моноядерные клетки периферийной крови(МКПК) выделяют на Ficoll- Hypague, клетки L929 и HL929 (субклон 1929 с дефицитом РНазы L) получают в культуре с монослоем, цитоплазматические экстракты клеток L929 и HL929 получают в глицери- НОЕОМ буфере, экстракты МКПК получают в NP40 лизионом буфере, все это согласно

известным методикам. Концентрация белка в экстрактах в интервале 1-15 мкг/мкл.

Активность 2-5А-синтетазы определяют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг на испытание) использованием поли (1) -по- ли(С)-агарозы. 2-5А выделяют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном-три-н-октилами- ном. Экстрагированные ТХК 2-5А затем ли- офилизуют и вновь растворяют в воде таким образом, что все образцы стандартизованы в объеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на мкл. Концентрации 2-5А, присутствующих в экстрактах МКПК, измеряют в испытании на радиосвязывание с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНазы L. Из 18900 dpm рзА4/32р/рСр (удельная активность 3000 Ci/ммоль). Amersham добавленных на одно испытание, 9400 dpm связываются с РНазой в отсутствие 2-5А. Примерно 9-14% рзАд/32 Р/рСр замещается в испытаниях, в которых добавляют 5 мкл выделенных образцов 2-5А. Концентрацию 2-5А в МКПК определяют сравнением с калибровочной кривой для аутентичных 2-5А. и это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в 25 мкг/мл. Концентрацию 2-5А, выделенных из МКПК, также измеряют в испытании с ядро-целлюлозой с клетками L929 в качестве источника РНазы L. Активация РНазы L в таком испытании основано на превращении поли /V/ р/рСр в растворимые в кислоте фрагменты. Примерно 5-20% всего количества поли /V/ p/pCp(1500dpm) расщепляется в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2-5А. Концентрации определяют по калибровочным кривым для аутентичных 2-5А (см. выше). Уровень свободной РНазы L измеряют испытании на радиосвязывание после добавления 20000 dpm РзА4/32 Р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание). Полученные результаты приведены в таблице.

Активность индуцированного интерфероном фермента (2-5А-синтетазы) в экстрактах МКПК. полученных от больных СЗЛом, РСКом, и СПИДом, измеряют in vitro и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей, как показано в вышеприведенной таблице. Концентрация 2-5А-синтетазы у больных СПИДом (3 и 5) были в 16 и 20 раз выше чем у нормальных пациентов (таблица,столбец 1). И напротив, концентрация 2-5А-синтетазы у больных СЗЛом ( 1), РСКом ( 2) и СПИДом с саркомой Капози (СК)(4) выше всего лишь в 1.3-5 раз, что подтверждает сделанные другими основные наблюдения.

Для определения того, являются ли такие измерения in vitro 2-5А-синтетазы указанием на функциональность фермента in vivo из МКПК экстрагируют 2-5А. Биологическую активность 2-5А из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКГЖ усиленно характеризуют в испытаниях на радиосвязывание и испытаниях с ядроцеллюлозой. Концентрации 2-5А аналогичны при испытании двумя методами (таблица, столбцы 2 и 3). Сходимость результатов, полученных методами А и В (таблица, столбцы 2 и 3), указывает на то, что 2-5А, выделенные из экстрактов МКПК человека, могут связываться и активировать РНазу L из клеток L929 в той же степени, что и аутентичные 2-5А.

Видимое отсутствие количественной корреляции между уровнями 2-5А-синтета- зы и эндогенными 2-5А при СЗЛ, РСК и СПИД (таблица, сравнить столбец 1 со столбцами 2 и 3) может быть впервые объяснено следующим образом. Определение 2-5А- синтетазы в испытаниях in vitro основано на частичной очистке через поли (rl) -поли (гС)- агарозу, соответственно, в таком испытании измеряют только свободную 2-5А-синтета- зу, а не 2-5А-синтетазу, активированную in. vivo с помощью дзРНК. Однако, непосредственно измеряют эндогенную 2-5А-синте- тазу плюс деградируемые 2-5А-ферменты (напр.2 - фосфодиэстераза и фосфатазы). Таким образом, аккумулирование 2-5А в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградиру- емых 2-5А-ферментов. Присутствие 2-5А в МКПК также указывает на то, что существует эндогенная дзРНК, до сего времени не обнаруживаемая как у здоровых людей, так и у больных. СПИДом.

Неспаренная двунитевая РНК является известной формой макромолекулярной РНК, в которой дестабилизация двойной спирали препятствует спариванию оснований. Неспаренная дзРНК хорошо известна за ее способность индуцировать интерферон, что указывает на механизм, несвязанный сам по себе с индуцированием интерферона.

Типичное лечебное воплощение неспаренной двунитевой РНК является синтетическая дзРНК, образованная комплексом полирибоинизиновой и полирибоцитидило- вой) урациловой кислоты, такой как rln г(Сх, V или G)n где х принимает значения от 4 до 29, напр., rln (Ci2 V/n далее называемая АМПЛИГЕН Исследованы многие полимерные неспаренные дзРНК, ведущие себя аналогично Амплигену. Ключевое лечебное преимущество неспаренной

дзРНК перед другими формами природных и/или синтетических дзРНК заключается в их пониженной токсичности по отношению к человеку и животным. Например, Lampson

и др. описывают первичные комплексы дзРНК, способные запускать в действие различные, связанные с интерфероном эффекты, однако токсичность подобных соединений исключает их использование для

0 лечения рака или родственных нарушений. Неспаренная дзРНК, как теперь известно, обладает лечебной активностью против определенных опухолей человека, в частности, против рака почки. Хотя в настоящее

5 время существует представление о дзРНК как о чисто индукторе интерферона, тем не менее дзРНК активны по отношению к определенным опухолям человека, которые вполне устойчивы к интерферону, что в пол0 ной мере отражено в заявке на Европейский патент № 83305426.5, автором которой является создатель настоящего изобретения.

В.другой заявке на патент, которая подана 26 августа 1986 под заглавием Модуля5 ции связанных с вирусом случаев с помощью двунитевых дзРНК изобретатель описывает ингибирование вируса СПИДа в культуре клеток человека использованием Амплигена в качестве протипной дзРНК.

0 Под неспаренными дзРНК имеются в виду такие дзРНК, в которых водородные связи (укладка оснований) между противостоящими нитями остаются сравнительно интактными, т.е. прерываются менее, чем

5 одной парой оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Термин неспаренная дзРНК следует понимать соответственно.

ДзРНК может представлять собой ком0 плекс полиинозината и полицитидилата с определенным отношением урациловых оснований или гуанидиновых оснований, напр., от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли I. поли(СА-29 х V или G).

5 ДзРНК могут отвечать общей формуле rln./CiaV/n. Другие приемлемые примеры дзРН К обсуждаются ниже.

Неспаренные дзРНК, рекомендуемые для использования в настоящем изобрете0 нии, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поля (Cn,V) и поли(Сп, G), где п означает цифровой показатель со значением от 4 до 29, и являющиеся неспаренными аналогами комплексов

5 полирибоинозиновой и полирибоцити- диловой кислот, образованных модифицированием rln, rCn с введением неспаренных оснований (урацила или гуани- дина) вдоль нити полирибоцидилата (rCn). Или же дзРНК может происходить из по/1и(1), поли(С) дзРНК модифицированием ри- Еозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (rln), напр., включением 2 -0-ме- тилрибозильных остатков. Такие неспарен- t-ые аналоги rln.rCn, из которых предпочтительны те, которые отвечают общей формуле rln. (Ci2, V), описаны Carter и Ts o в патентах США № 4130641 и 4024222, описания которых даются здесь в качестве ссылок. Описанные в указанных патентах дзРНК, как правило, приемлемы для использования согласно настоящему изобретению.

Сцепифичные примеры неспаренных дзРНК для применения в изобретении включают:

поли(1). поли(С4,У)

поли(1). поли(С7,У)

поли(1), поли(С13,У)

поли(1). поли(С22,/)

поли(1), поли(С20,С)

ПОЛИ(1), ПОЛИ(С29,6) И

поли(1). поли(Ср/23 G р.

Фармацевтические композиции в соот- в тствии с настоящим изобретением вклю- чгиот композиции, предназначенные для парентерального введения в приемлемом фармацевтическом носителе. Так могут быть приготовлены парентеральные растворы, суспензии и дисперсии так, как это требуется согласно известным фармаколо- г ческим методам в стерильной или несо- доржащей пирогенов воде в качестве растворителя/разбавителя, возможно так- жо с физиологически приемлемыми солями.

0

5

0

5

0

5

Количество вводимой неспаренной дзРНК предпочтительно достаточно для достижения пиковой концентрации в крови от 0,01 микрограмма на миллилитр концентрации дзРНК во всей жидкости организма до 1000 микрограмм на миллилитр в систематической системе кровообращения сразу же после введения в точке, удаленной огместа вливания.

Или же эффективное количество может быть добавлено к кровяному продукту непосредственно перед инъекцией реципиенту. В таких случаях врач может просто сослаться на стандартную таблицу для объемов жидкости в организме, в которой приводятся соотношения между весом реципиента и его или ее объемом жидкости, в сумме должно быть объем жидкости организма пациента плюс объем жидкости, приводимой в равновесие с необходимым количеством дзРНК. Пациент весом шесть- десят-семдесят килограмм имеет в организме жидкость объемом примерно пять-шесть литров.

Формула изобретения Способ выявления вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека, включающий отбор крови с последующей ее обработкой, анализом и вынесением суждения, отличающийся тем, что обработку крови проводят на наличие 2-5А- синтетазы и при ее обнаружении судят о наличии вируса человеческого иммунодефицита.

Использование: вирусология. Сущ- нос-ть изобретения: описаны направляемые HIV ингибиторы природной 2 -5 А противовирусной защитной системы, диагностические методики и вспомогательные средства для лечения вирусных нарушений. Выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РНазы L больных с синдромом заболевания лимфатических узлов, родственным СПИДу комплексом и синдромом приобретенного иммунодефицита. У таких пациентов функциональные 2-5А не способны активировать РНазу L в моноядерных клетках периферийной крови, эндогенная дзРНК, эндогенная дзРНК, в особенности неспаренная дзРНК, активирует 2-5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А.4 ил. 1 табл.

Активность 2-5А-синтетазы, концентрация эндогенных 2-5А, уровень свободной РНазы L присутствие ингибитора РНазы L в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом

a стандартное отклонение 9%

определено в испытании по радиосвязывании /дублировано/

6 определено в испытании с ядро-целлюлозой /дублировано/, стандартное отклонение 1 % г определено в испытании по радиосвязыванию /дублировано/, стандартное отклонение 1 % А определено в испытании по расщеплению рРНК.см. также фиг.1 е в среднем для 7 контрольных образцов /дублировано/ ЖНО-не определялось

28 С18СПродолжение таблицы

НОРМА & 9 10

cpue.f

JC3/7 РСК спид KQHtnpo/ib

8

28С18СФиг.г

(.3

IrnaduzA

I

HHwlepn Стимумт Шиметиды

Стадий В

Фцг.1+

Стадия В

tmadt/я С

Катализ

РНазаЬ

i