после ИФН терапии с дним ИФН при лечении вирусной инфекции хронического гепатита В (СНВ) (Furuta e; al. J. Interferon Res., vol. 7, page 111).
Однако в общем попытки использовать активность 2 -5 А синтетазы в лимфоцитах периферического кровообращения (PBL) в качестве маркера для оценки до какой степени различные опухоли и вирусы являются чувствительными к лимфокинам оказались неудачными.
Заявитель полагает, что ,это является случайностью, потому что 2 5 А синтетаза является только одним из ферментов, биохимического каскада, индуцируемого лим- фокинами, и особенно потому, что 2 5 А синтетаза может оказывать антивирусное и противоопухолевое действие через активацию более позднего фермента в пути(ях), заканчивающемся РНК-азой L.
Недавнее описание очищенной 2 5 оли- го А синтетазы показало, что она является очень нестабильной в присутствии ds РНК (Rovnak and Rame, J. Interferon Res., vol. 7, p. 231, 1987).
Заявитель обнаружил новую роль ds РНК в отношении коррекции различных нарушений в РНК-азе L, что как также показано заявителем, является терапевтически важным для успешного лечения рака, имму- нологических и вирусных заболеваний.
РНК-аза LPHK-аза L в активированном состоянии ассоциирована со специфическим расщеплением вирусной РНК и, по-видимому, оберрантные клеточные РНК ассоциированы с фенотипом злокачественной клетки (неконтролируемая пролиферация).
В недавней публикации (Lancet 1987 г., vol. 1, р. 1286) заявитель описал различные дефекты в РНК-азе L, вторичные к выработке ингибитора HIV (вируса человеческого иммунодефицита) РНК-азы L. Заявитель разработал успешный терапевтический режим, который заключается в графике дози- рования ds РНК, который позволяет как при прямом, так и непрямом механизмах действия вытеснять ингибитор НIV из РН К-азы L, приводя в результате к улучшению клинического состояния пациента и снижению нагрузки HIV.
Изобретение иллюстрируется следующими рисунками и примерами.
На фиг. 1-3 представлены фотографии пластин электрофореза в полиакриламид- ном геле, показывающие указанное количество треков и полос или зон, соответствующих продуктам расщепления специфического РНК-азой L вдоль каждого трека; на фиг. 4 - график из трех частей,
имеющих отношение к трем различным пациентам, где сравниваются количества белых кровяных клеток (линия, соединяющая кружки) с количеством 2-5 А синтетазы
(линия, соединяющая треугольники) в зависимости от времени лечения.
Изобретение включает диагностические процедуры для оценки дефектов и биохимических нарушений в РНК-азе L и может
быть использовано для коррекции таких дефектов, с помощью ds РНК, предпочтительно неспаренной ds РНК, назначаемой необязательно до или конкурентно с введением лимфокина, такого как интерферон
или интерлейкин.
Процедуры определения наличия недостатка характерных продуктов расщепления РНК-азой L в образце крови пациента, в частности в мононуклеарных клетках пациента, и использование наличия и/или времени образования таких продуктов расщепления в качестве маркера для начала лечения с помощью ds РНК также описаны.
Терапевтические методы лечения раков, особенно имеющих опухолевые клетки, устойчивые к лечению одним интерферо- ном, и вирусных состояний, включая заболевания, вызванные членами семейства
ретровирусов, также описаны.
В ранее цитированной статье из Lancet образцы РНК-азы L от индивидуумов, зараженных HIV, не показывают какой-либо детектируемой биоактивности. В частности
SCP зоны, т.е. зоны продуктов специфического расщепления, лишены фрагментов РНК, которые показывают, что РНК-аза Ly этих пациентов была эффективно инактиви- рована ингибитором. В противоположность
этому, у здоровых нормальных субъектов in vivo активированную РНК-азу L обнаружить очень легко. Следовательно, отклонение от нормы РНК-азы L в человеческих опухолях ассоциировано с новыми продуктами расщепления (N СР).
Новые продукты расщепления (N CP) отличаются от продуктов специфического расщепления (S СР) и идентифицируются человеческими клетками без нормальных
механизмов контроля роста клеток и пролиферации вируса.
На фиг.1 показана кинетика активности РНК-азы L, полученной из периферических лимфоцитов нормального индивидуума, по- 5 добно Полосе 2 из указанной выше статьи заявителя (Lancet). Как описано ранее, аналитический метод заключается в измерении активированной РНК-азы LB цитоплазмати- ческом экстракте мононуклеарных клеток путем определения способности генерировать продукты специфического расщепления при инкубации с источником 28 S и 18 S РНК. Примененные процедуры соответствуют описанным K.Kariko and J.Ludwig, Biochem. Biophysics. Research Communication, vol. 128, 695, 1985 и VVreschner et al. Nucleic Acid Research, vol. 9,1571,1981. Рибосомальная РНК получена из HL 929 клеток, которые генетически утратили РНК-азу L
Эти L Н929 клетки депонированы в соответствии с Будапештским договором в Коллекции американских типовых культур, Рокквилл, Мэрилэнд, США под номером АТСС Ne CK L 9659.
При наблюдении в течение продолжительного периода времени 1700 минут (около 26 ч) заявитель обнаружил, что РН К-аза L от нормальных индивидуумов в некоторых случаях способна образовать N СР (Полоса 8 на фиг. 1). Отметим, что самая ранняя точка детекции N СР у нормального индивидуума отмечается после многих часов инкубации.
Однако N СР видны в течение нескольких минут инкубации РНК-азы L, когда используют лимфоциты от пациентов с лейкемией. Это четко показывает фиг.2, когда клетки от 3 лейкемических пациентов (пациенты А и В с хронической миелогенной лейкемией CML) сравнивают со сравнимыми от нормального индивидуума, пациента С. Отметим, что у пациента с лейкемией (пациенты А и В, фиг.2), S СР никогда не видны, а N СР видны после такой короткой инкубации, как 1-4 мин. Поразительный контраст наблюдается у нормального индивидуума (доброволец, обозначенный С), только S СР ... и нет никаких N СР -- видны в кинетических образцах, выдержанных до 60 мин.
Следовательно, наблюдается ранее недетектируемая биохимическая аномалия, с которой ключевой фермент (РНК-аза L), ассоциированный с механизмами защиты организма против рака, иммунологических и вирусных заболеваний, работает ускоренным и .по-видимому, неконтролируемым образом. В отдельных экспериментах проведено сравнение относительных способностей двух различных клеток (клетки с аномальной РНК-азой L) отклонять вирусное заражение. Было обнаружено, что титры потомства5вирусов были значительно выше у клеток с аномальной активностью РНК-азы L, которая так быстро генерируют NCP.
Заявителем продемонстрировано и описано как двунитевые РНК, особенно неспаренные, нарушают нормальную кинетику РНК-азы и продуктов расщепления и что скорость нарушения функции ds РНК может быть увеличена предварительной экспозицией с лимфокинами.
Под неспаренными ds РНК понимают те РНК, у которых водородные связи между нитями являются относительно интактны- ми, т.е. прерываются в среднем не менее чем на одной паре оснований в каждых 29
последовательных остатках оснований. Термин неспаренная ds РНК следует понимать соответственно, ds РНК могут быть комплексом полиинозината и полицитиди- лата, содержащим некоторое количество оснований урацила или гуанидина, например, от 1-5 до 1 в 30 таких оснований(поли I поли (С4-29Х И или G). Альтернативно, соответствующие олигонуклеотиды (маленькие фрагменты нуклеотида) могут быть комплексно
связаны с соответствующими комплементарными полинуклеотидами или олигонук- леотидами в определенных условиях.
ds РНК могут быть поли I поли С, U, в которых отношение С к U составляет примерно 13 к 1, а коэффициенты седиментации поли I и поли С, U оба менее 9 и в пределах 2 единиц для каждого, и оба предпочтительно около 6,5-7,5.
РНК могут иметь общую формулу г ln
г (Си-14, U)n и специфически г ln r(Ci2, U)n. Другие подходящие примеры ds PH К описаны ниже.
Неспаренные ds РНК, предпочтительные для использования в настоящем изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поли (Cn, U) и поли (Cn, G). в которых п является целым числом, имеющим величину от 4 до 29, и являются неспа- ренными аналогами комплексов
полирибоцитидилата (гСп), например путем включения 2 -0-метилрибозильных остатков. Эти неспаренные аналоги г ln гсп, предпочтительными среди которых являются аналоги общей формулы г ln гсп, описаны Carter and Ps O в патентах США 4 130
641 и 4 024 222. Описанные там ds РНК обычно пригодны для использования в соответствии с настоящим изобретением.
Конкретные примеры неспаренных ds РНК для использования в соответствии с изобретением включают:
поли (I) поли (С4.И)
поли (I), поли (С, И)
поли (I), поли (Счз, И) поли (I), поли (С22, И)
поли (I), поли (С20, G)
поли (I), поли (С29, G) и
поли (I), поли (Cp).
Количество введенной неспаренной ds РНК предпочтительно является достаточным для достижения пика концентрации в крови от 0,1 мкг/мл ds РНК до 100 мкг/мл в системном кровообращении сразу после дистального введения отточки инфузии.
Три индивидуума, о которых было сообщено ранее, с лейкемией (CML), продемонстрировали новый дефект РНК-азы L.B ассоциации с неконтролируемым ростом у них клеток злокачественной опухоли и значительным клиническим ухудшением (недомогание, потеря веса, неспособность противостоять многочисленным инфекциям) при различных сопутствующих вирусных инфекциях, включая герпес зостер, CMV EBV, герпес симплекс или гепатит. Некоторые пациенты также страдали хроническими грибковыми инфекциями рта.
Заявителем оценено как новое биохимическое расстройство, так и разработана схема введения ds РНК, одной или в сочетании с лимфокином, которая эффективно корректирует аномальность РНК-азы L и в результате проводит к значительному клиническому улучшению, характеризующемуся значительным снижением тяжести опухоли и значительным улучшением общей антивирусной и иммунологической защиты как доказательства снижения взаимопротекания вирусных и грибковых инфекций.
Лимфокины включают интерфероны (альфа, бета, гамма), предпочтительно ин- терферон альфа, интерлейкины, особенно интерлейкины (1, 2 или 3) и рекомбинатный интерлейкин-2 (plL-2), и фактор некроза опухоли (ФНО). Также включены активированные лимфокином киллерные клетки (клетки-убийцы) (L AK), образующиеся у животных в ответ на обработку лимфокином.
При использовании интерферона (альфа) в качестве лимфокина должно быть обес- печено количество от 0,01 до 100000 МРЕ/мл жидкости тела пациента.
Когда лимфокином является IL-2, предпочтительно pIL, доза лежит в интервале от примерно 10 IL-2 единиц/кг массы тела пациента до величины (достигающей неприемлемых уровней токсичности у такого пациента) 10 IL-2 единиц. Однако наиболее эффективными и допустимыми с точки зрения токсичности величинами являются величины в интервале от примерно 103 до примерно 10 IL-2 на кг массы тела.
При введении обоих агентов, ds РНК и лимфокина, как описано ранее, они могут быть введены в виде смеси или раздельно, но одновременно или последовательно.
Введение ds РНК и лимфокина в сочетании включает случай, когда оба агента
введены вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых оба агента вводят раздельно, но одновременно, например через отдельные внутривенные
вливания одному и тому же индивидууму. Введение в сочетании также включает отдельное введение одного из лекарств, при котором одно из лекарств дается первым, а затем после короткого перерыва - второе.
0 На фиг.З показан типичный случай биохимического восстановления у 3 пациентов (ТАТК, ДЕГД, ДА1К), сначала подвергнутых действию низкой дозы лимфокина (альфа ИФН в дозах 0,5-3,0 миллиона МРЕ/4-7 раз
5 в неделю).
Каждый пациент весил около 60 кг. Отметим, что в каждом случае введение одного лимфокина было явно недостаточно, чтобы вызвать любое детектируемое улучшение в
0 дефекте РНК-азы. Все пациенты показали только N СР, когда получали только лимфо- кин. Пациент () имел короткий период ответа на традиционную химиотерапию (гидроксимочевина и т.п.), во время которой
5 его лимфоциты временно вновь приобретают S СР активность; однако его заболевание дает рецидив с превращением из S СР в N СР, ассоциированный во времени с клиническим ухудшением, и он получал лимфокин
0 с измеряемым клиническим или биохимическим улучшением. В каждом случае, в котором затем была введена ds РНК в сочетании с лимфокином, резкое клиническое улучшение и восстановление биохимической нор5 мы РНК-азы L происходило по-видимому одновременно.
На рис. 3 показана эффективность не- спаредоой ds РНК г ln г(Сц-14) или АМПЛИ- ГЕ Н а &У торговое название НЕМ Research,
0 Роккевилл, Мэрилэнд, США), даваемой в интервале доз от 40 до 300 мг (вводится внутренне дважды в неделю). Наблюдалось достижение подобных клинических эффектов путем контроля фермента (РНК-азы L) и
5 введением одной неспаренной ds РНК, но при этом требовалось часто в 2-20 раз большее количество, а начало клинического от- веста значительно задерживалось.
При сочетании анализа на РНК-азу L и
0 разумного использования неспаренной РНК, одной или в сочетании с лимфокинами, создается возможность стойкого улучшения общего клинического состояния (снижения вирусных и грибковых инфекций), тогда как
5 тяжесть опухоли существенно снижается (как показано на фиг.4, обсуждается ниже). Важно, что теперь имеется возможность вызвать эти значительные клинические изменения на основе стоимость/эффект, а также свести к минимуму, если не устранить, токсичность для пациента этих реагентов. Таким образом данное изобретение является широко применимым с различными лимфокинами, а также с большим семейством дву- нитевых РНК, которые без разработанной Стратегии могли бы лишь в незначительной степени использоваться в клинике.
График на фиг.4 иллюстрирует резкие биохимические и клинические эффекты, достигаемые на 3 пациентах с лейкемией, для которых профили РНК-азы L приведены на фиг. 3. На фиг.4 представлены графики зависимости от времени количества белых кровяных клеток (клетки на кубический мил- л|иметр, представлены соединенными о), и активность 2 -5 А синтетазы периферических лимфоцитов (представлены соединенными треугольниками). Для выделения Лимфоцитов для измерения 2 -5 А синтетазы приблизительно 1х106 мононуклеарных клеток в периферическом кровотоке сначала очищают с помощью стандартной методики Фикло Гипак. Во всех трех случаях прежняя химиотерапия или прежняя терапия лимфокином дала очень ограниченную пользу, как доказывается высоким количеством белых кровяных клетокЛЛ/ ВС), например, более 3000 на мм , и низким содержанием 2-5 А синтетазой, выраженной в наномолях/мг клеточного белка. Однако неспаренная ds РНК, добавленная к клеткам, которые сначала были обработаны низкой дозой лимфокина, показала кон- курентное восстановление в ряде циркулирующих опухолевых клеток (счет W ВС), возвращая к нормальному состоянию РНК-азу L лимфоцита и улучшая общее антивирусное состояние.
Клиническая эффективность таких режимов дает необычно большую продолжительность и у некоторых пациентов в конце
концов может встретиться строгий клинический критерий вылечивание. Заявителем оценена эта возможность неарелевантной животной модели, на которой показано не
только ингибирование роста опухоли, но повышение выживания (,001) при схеме лечения ds РНК; одной или в сочетании с лимфокинами, исходя из относительного уровня РНК-азы L и оживления всего пути
2 -5 А (синтетаза) РНК-азы L также отмечается, что такое лечение увеличивает природную иммуновыживаемость (N К клетки, LAK клетки и т.п.), а также является непосредственно благоприятными для снижения числа
жизнеспособных опухолевых клеток.
Дополнительные подтверждающие исследования указывают, что эти режимы лечения, а именно, ds РНК, одна или в сочетании с лимфокинами, действительно придают
различными опухолевыми клетками большую чувствительность к лизису, даже хотя сами лимфокины обычно не повышают эффективно чувствительности опухолевых кле- ток-мишеней, как и не дает резкого
усиления иммунной функции.
Формула изобретения Способ определения биохимических нарушений в РНК-азе L при вирусных и онкологических заболеваниях, предусматривающий инкубацию 28 S и 18 S РНК с РНК-азой L, содержащейся в цитоплазматическом экстракте мононуклеарных клеток пациента, электрофоретическое разделение фрагментов РНК в полиакриламидном геле и идентификацию дефекта в ферменте по наличию зон специфического распределения на полученных форёграммах, отличающийся тем, что на фореграмме дополнительно выявляют новые зоны расщепления спустя несколько минут после инкубации.
в
Ј
О
лл
в
t
v
ее
со со
ь
--+++- + +
+ + + - - + + +
-.-O----O--O-------O
--0---0.
-№. 5
DEFD
OALR
0-...„о
TATR
40
-20
X)..
- -- .-o
