СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита) представляет собой одну из основных угроз двадцатого столетия для здоровья людей. Вследствие его меняющейся биологической природы, коварных способах распространения от индивидуума к индивидууму, "скрытого" периода развития болезни, что делает затруднительным само его обнаружение, СПИД несомненно стоит в ряду эпидемиологических проблем, требующих беспрецедентных усилий. Даже при значительных затратах, вложенных на увеличение надежности диагностики СПИДа, созданные к настоящему времени методики все еще крайне недостаточной степени отвечают необходимым требованиям четкого контроля этой проблемы для любой группы населения (см. , например, материалы рабочей группы, озаглавленные "Опыты испытания антител к HTLV-III, современные данные по отбору, лабораторному и эмидемиологическому коррелированию", под эгидой Центра лекарств и биологических средств FDA, Национальные Институты здоровья и Центры контроля заболеваний, 31 июля 1985 г., Национальный Институт здоровья, Бефезда, шт. Мэридаид; см. также Budianskys, Nature 316, c, 96, 11 июля 1985 г.).
Существует несколько названий вируса иммунодефицита человека (HIV), для вируса HIV, выделенного в Пастеровском институте (Париж, Франция), обозначением служат LAV, а для вируса HIV, выделенного в Национальном институте здоровья, Бефезда, шт. Мэридаид США, обозначением служат HTLV-III (лимфотропный вирус Т-клеток человека). В настоящем тексте вируc HIV часто будет называться в его общем смысле или же будет обозначаться как HTLV-III или LAV, или HIV, но без намерения провести различия между ними. Более того, термин HIV в настоящем описании включает всякие другие любые вирусы, связанные с заражением СПИДом, вне зависимости, выделены ли они или нет. Имеется в виду, что вирус HIV в единственном числе включает любой тип HIV независимо от его геномного содержания. Аналогично, симптомы СПИД в общем виде будут называться, как включающие симптомы, вызываемые HIV (согласно приведенному определению), РСК (родственный СПИДу комплекс), синдрома заболевания лимфатических узлов (СЗЛ) и другими вирусами, вызывающими, по существу, аналогичные клинические симптомы.
В настоящее время в лечебной практике наметился один из двух подходов: иммунологический (создание вакцины) и непосредственная атака на сам вирус (противовирусная терапия). Поначалу создание вакцины казалось весьма многообещающим, по крайней мере теоретически. Однако новые сведения о природе вируса в значительной степени ликвидировали эти ожидания. Дело в том, что вирус, видимо, легко подвергается мутации или изменению своей основной биохимической структуры, в результате чего определяющие вирусные антигенные "детерминанты", необходимые для эффективности вакцины, легко подвергаются мутации или изменению. Например, HTLV-III, выделенные в Калифорнии, Мэриланде и Англии, как недавно было найдено, значительно отличаются друг от друга при тщательном анализе их геномного содержания. В результате проведенных исследований сделан вывод о том, что вакцинация против HIV не даcт устойчивых длительных результатов в отличие от действительно положительных длительных результатов, исторически достигаемых в случае большинства других вакцин, например, направленных против вируса полиомиелита, вируса кори и т. д.
При втором подходе к проблеме (непосредственная атака вируса) учеными испытан ряд соединений, в том числе: AZT, HPA-23, сурамин, рибавирин, интерферон, фаскарнет и т. д. Эти соединения включались в лабораторные или клинические исследования при ограниченных или неквалифицированных данных о их терапевтическом действии. В самом деле, в почти каждом случае имеются свидетельства о высокой токсичности и/или неблагоприятных побочных эффектах (см. , например, обзор, подготовленный M.Clark, Newsweek, с. 71, 5 августа 1985 г., а также G. Wallis, Timl, с. 40-47, 12 августа 1985 г.). Ни одно из таких лекарств не является, по существу, новым и не способно быть селективно направленным против первопричины нарушений, а именно против мультипликации HIV в определенных клетках. К примеру, HPA-3 представляет собой комбинацию тяжелых металлов (отголосок применения в двадцатых годах - в эпоху, предшествующую открытию пенициллина, мышьяка для лечения венерических заболеваний), сурамин, по-существу, является противопаразитным средством (сонная болезнь) и фаскарнет является средством против вируса лишая. Последние два соединения могут ингибировать родственный HIV фермент, названный "обратимой транскриптазой", однако имеется недостаточно сведения, что такое ферментативное ингибирование в самом деле приведет к значительному терапевтическому действию или профилактике заболевания, или его облегчению. Применение AZT может быть связано с небольшим увеличением срока жизни жертв СПИДа, но сам по себе он в высшей степени токсичен и не уничтожает HIV (R. Yarchoan и др., Lancer, 15 марта, с. 575, 1986 г.; R.E.Chaisson и др., New England (Journal of Medicine, т. 315, с. 1611, 1986 г.).
СПИД вызывает прогрессирующие нарушения в иммунной системе в результате заражения вирусом иммунодефицита человека (HIV). На ранних стадиях болезни ответственные за иммунитет клетки теряют свои свойства в результате потери Т-клеток (продуцируется тимусом), экспрессирующих так называемый Т4 антиген, т.е. ту часть Т-клеток, которая состоит в основном из фага-помощника и индуктора Т-клеток. Дефицит Т4 в клетках может привести к определенным видам дефицита в передающейся клетками иммунности, в том числе: дефицита ЕУ (естественных клеток-убийц), АЛУ (активированных лимфонином клеток-убийц) и цитолитичных Т-клеток. При СПИДе отмечен также дефект лимфоцитов, происходящих из костного мозга.
СПИД, видимо, является прогрессирующей болезнью, хотя время перехода от одной фазы к другой может меняться. Для фаз развития СПИДа существует классификация. Асимптоматические индивидуумы, зараженные HIV, иногда называются сероположительными ввиду присутствия в их крови антител к вирусу (M. G.Sarigadharan и др., Science, т.224, с.506, 1984 г.). Если у них не имеется других маркеров, их относят к пациентам BPI-стадии согласно классификации Вальтера Рида (R.R.Pedfield и др., New England Journal of Medicine, т. 224, с.131, 1986 г.). Эту стадию также называют предРСК (РСК - родственный СПИДу комплекс), хотя некоторые индивидуумы на этой стадии могут так и не показать характерной для РСК симптомологии. Некоторые из таких пациентов могут иметь симптомы заболевания лимфатических узлов (ВР2) и иметь дефицит Т-клеток (ВРЗ). После этого происходит уменьшение способности лимфоцитов претерпевать стимулируемую антигеном пролиферацию и стимулируемое антигеном образование гамма-интерферона, и пациенты на такой ВР4-стадии начинают терять замедленную кожную гиперчувствительность. Пациенты на ВР5-стадии становятся обычно вялыми. Они подвержены заражению опоясывающими лишаем, афтозному стоматиту (молочнице) или проявляют симптомы РСК, которые включают продолжительные ознобы, потение по ночам, слабость, понос и/или потерю веса. Этот период РСК также характеризуется прогрессирующим падением иммунитета. Наконец, пациенты на BPG-стадии подвержены любым инфекциям, т.е. речь идет об откровенном СПИДе или СПИДе в "полном расцвете", когда 50% пациентов умирает в течение 12 месяцев (H.W.Murray и др., New England Journal of Medicine, т.310, с. 883, 1984 г.).
Сущность изобретения.
Открыто вещество - ингибитор, выделяющееся или понуждаемое к выделению клетками, зараженными вирусами иммунодефицита человека. Этот ингибитор, видимо, физически связан с ферментом PHазой L - концевым продуктом на пути образования 2 -5 -олигаденилят-PHаза L приводит к выходу из строя всей иммунной системы, что позволяет вирусам бесконтрольно размножаться. Описана техника идентификации таких ингибиторов либо непосредственно, либо косвенно по отсутствию PHазы L или неактивности PHазы L, или присутствию ингибиторов промежуточных соединений на пути образования 2 -5 - A-PHазы L, при этом ингибитор (ы) служит маркером для обнаружения присутствия HIV или родственных вирусов, дающих по существу такие же клинические симптомы. Также обсуждается прогнозирующее значение такого маркера с точки зрения развития в полном расцвете СПИДа у пациентов, в частности, у пациентов, имеющих антитела к HIV в периферийной крови и тканях, включая кровь, фракции крови, клетки трансплантированных органов и клеточных экстрактах. Описаны методики активирования PHазы L и/или удаления, или дезактивации ингибирующего PHазу L вещества. Частью изобретения являются лечебные методы дезактивации ингибирующих PHазу L веществ (а) или вируса, направленного на такие ингибиторы. В изобретение включены способы получения антител к таким вирусам, как in vivo, так и in vitro использованием в качестве антигена специфического ингибитора PHазы L или вируса, направленного на ингибирование биохимических промежуточных соединений на пути образования 2'-5'-A-PHаза L.
Изобретение включает использование дзРНК в фармацевтической композиции и способ активации PHазы L, удаления или дезактивации специфического ингибитора PHазы L или вируса, направленного на ингибирование биохимических промежуточных веществ на пути образования 2'-5'-A-PHаза L как у животных, так и у человека, композиция представляет собой сочетание дзРНК, предпочтительно неспаренной дзРНК, и лимфокина, такого как интерферон или другого специфичного противовирусного средства, чье действие усиливается за счет выделения и сохранения зависящего от дзРНК пути образования 2'-5' A.
Рекомендуют, чтобы композиция содержала дзРНК и интерферон в отношении 0,01-1000 мг дзРНК на 0,1-100000 I RV интерферона.
Изобретение, кроме того, включает способ придания устойчивости биологическим жидкостям или клеткам (предпочтительно жидкостям или клеткам человека) по отношению к вирусным инфекциям путем увеличения их сопротивляемости или путем смягчения действия инфекции HIV, способ заключается в смешивании или контактировании указанных биологических жидкостей или клеток с эффективным количеством дзРНК, т.е. количеством дзРНК, ингибирующим HIV или активирующим PHазу L. Биологическая жидкость может представлять собой кровь человека или фракцию крови, например, предназначенных для переливания или диализа. Клетки могут происходить из намечаемой к пересадке кожи или трансплантируемого органа.
Кроме того, изобретение включает также способ удаления или дезактивации веществ, ингибирующих образование PHазы L, из устройства для обработки парентеральных жидкостей или смягчения действия инфекции HIV из такого устройства, и способ заключается в контактировании указанного устройства с композицией, содержащей эффективное, ингибирующее HIV, активирующее PHазу L количество дзРНК.
Изобретение также включает лечебные методы и композиции, предназначенные для лечения пациентов, пораженных HIV, в том числе и пациентов с симптомами СПИДа путем подавления или исключения специфичного к HIV ингибиторах или вирус-направляемых ингибиторов промежуточных соединений на пути превращения 2'-5' A-PHазы L и/или активирования PHазы L. Композиция включает дзРНК и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель, а также инструкции по использованию при лечении вызываемых ретровирусами или лимфотропным вирусом Т-клеток, вирусом заболеваний, например, СПИД или других вирусов человека, на чью мультипликацию будет действовать активация бездействующей PHазы L.
Таким образом, в виде примеров описаны лечебные способы селективного ингибирования вирусов человека, особенно HIV, без заметной токсичности к обычным клеткам; способы ингибирования, замедления или профилактики индивидуума от заражения HIV; способы профилактики или лечения родственного СПИДу комплекса и родственных СПИДу нарушений у человека; способы обработки биологических жидкостей, клеток и тканевых продуктов человека с целью предотвращения или фиксации инфекции или загрязнения HIV, а также способы коррекции определенных нарушений, связанных с HIV, в том числе потерю рецепторов интерферона на клетках в пределах иммунной системы во всех случаях, основанных на сокращении или снижении уровня внутриклеточной 2'-5' А-cинтетазы и дезактивации PНазы L и снижении или утрате внутриклеточных дзРНК в выбранных клетках иммунной системы. Также описаны фармацевтические композиции, предназначенные для использования в перечисленных способах. В изобретение помимо лечения человека включено также и лечение животных.
Применение дзРНК приспособлено для коррекции специфичных нарушений, связанных с инфекцией HIV, в том числе: утрате PHазы L и зависимых от дзРНК ферментов (например, протеинкиназы) на различных определяющих клетках в пределах иммунной системы, сокращении - уменьшении внутриклеточной 2'-5' А-синтетазы в различных определяющих клетках в пределах иммунной, защищающей организм системы и снижении или утрате внутриклеточной дзРНК, и уменьшении или утрате биоактивных 2'-5' А-олигомеров в различных решающих клетках в пределах иммунной, защищающей организм системы.
Нарушения в клеточной "первой линии обороны" (пути образования 2'-5' олигоаденилята) при СПИДе.
Различные исследования указывают на то, что путь образования 2'-5'-олигоаденилята (в медицинской литературе также называемый 2'-5' путем образования интерферона) при СПИДе нарушается. Такой путь образования является составной частью защитной системы организма от инфекций. При СПИДе и различных предшествующих ему состояниях, например, РСК и СЗЛ (синдром заболевания лимфатических узлов) непосредственно участвующие на этом пути образования ферменты - факторы "включены" или активированы, и все же вирус СПИДа мультиплицируется. Например, уровень интерферона, как правило, повышен, также как повышен уровень фермента 2'-5'-синтетазы. Однако механизм такого повышения, в частности неспособность системы, включенной по меньшей мере частично, ингибировать HIV по меньшей мере хоть до какой-то степени, оставался полной загадкой до тех исследований, о которых сообщается здесь.
В результате собственных исследований идентифицирован ингибитор, который вторичен по отношению к инфекции HIV, и установлено, что этот ингибитор парализует противовирусный защитный механизм, противостоящий СПИДу в его полном развитии.
Показана характеристика PHазы L у больных РСК-СПИДом, у которых быстро исчезают признаки HIV в периферийной крови в результате лечения дзРНК (зарегистрированное фирменное название АМПЛИГЕН R, НЕМ Research Inc., Ровиль, шт. Мэриленд, США). Об отсутствии или присутствии активированной PHазы L в цитоплазмических экстрактах моноядерных клеток периферийной крови (МКПК) пациентов делают вывод по способности образовывать специфические продукты расщепления (СПР) из 28S и 18S рРНК согласно методикам K. Kariko и J. Ludwig, Biochem Biophys - Research Communication, т. 128, с. 695, 1985 г. ; D.H.Wreschner и др., Nucleic Acid Research, т.9, с.1571, 1981 г. Рибосомная РНК (содержащая две молекулярные разновидности, обозначаемые как 28S и 18S) ведет себя аналогично вирусной РНК (например, HIV) по способности расщепляться под действием активированной PHазы, но только не дезактивированной PHазы. Активированная PНаза характеризуется тем, что в своей молекулярной структуре связана преимущественно с 2-5 А-олигомерами и очень мало связана, если вообще связана, с ингибитором. В табл.1 приведены обобщенные данные лечения 10 пациентов Амплигеном.
Экстракты клеток HL 929 (PHаза L минус), использованные в качестве источника рибосомной РНК, инкубируют 1 ч в отсутствие или присутствие цитоплазмических экстрактов МКПК здорового контрольного объекта или больных РСК и СПИД (каждый из которых получает свой кодировочный номер) перед лечением Амплигеном.
До лечения экстракты от всех больных РНК-СПИДом также дают отсутствие активации (отсутствие СНР) даже при добавлении экзогенных биоактивных олигоаденилятов /2'-5'-p3A3 (10-8 М)/, что подтвердило невозможность присутствия даже следов молекул функциональной PHазы L в лимфоцитах больных до приема Амплигена. И наоборот, параллельно с лечением Амплигеном наблюдается прогрессирующая активация in vivo PHазы L; у больного 6; больного 7 (СПИД), а также различных больных по табл.1. Только у пациента под номером 5 не удалось активировать PHазу L в результате приема дзРНК и, как и следовало ожидать, он умер от вторичных всевозможных инфекций.
Экспериментальные данные. Впервые наблюдается присутствие в значительных концентрациях 2-5 A-олигомеров в лимфоцитах, не получивших лечения больных по всему клиническому спектру СПИДа. Однако в отличие от нормальных индивидуумов PHаза L неактивна у больных РСКом и СПИДом, не получавших лечения. Также замечено, что если полученные от больных РСКом-СПИДом препараты PHазы L первоначально интенсивно промыть (перед испытанием), в том числе и трихлоруксусной кислотой (ТХК), в результате эти препараты PHазы L восстанавливают свою функциональность, т.е. они оказываются способны катализировать специфичное расщепление или макромолекулярную РНК, и их следует считать активными. Рядом опытов по восстановлению решено, что ингибитор PHазы L вымывается или обрывается, но если его добавить вновь, снова прерывает, иными словами ингибирует реакции PHазы L.
Накопленные к настоящему времени данные указывают, что статус PНазы L (активной или неактивной) дает важный прогностический параметр для HIV и что специфическая обработка при участии двунитевых РНК может исправить характерные для HIV нарушения. Клинический спектр индивидуумов от асимптоматических носителей HIV (например, больной 8 табл. 1) до ранних заболеваний (например, РСК или СЗЛ, больные 2, 3, 9, 10, 1 и 4) и СПИДу в полном расцвете подвергнут действию дзРНК с целью определения, можно ли заставить ингибитор освободить PHазу L, при этом ожидалось, что такое событие на молекулярном уровне может привести к понижению уровня HIV и многообещающим клиническим улучшениям. Индивидуумы (с примерной массой 60 кг) принимали дважды в неделю 50-250 мг специфической дзРНК, названной Амплигеном. Известно, что 2'-5'-олиго А-синтетаза является зависимым от дзРНК ферментом, и была сочтена резонной, возможность замещения ингибитора в PНазе L путем постепенного увеличения концентрации внутри клетки специфичных биоактивных 2'-5'-олигомеров использованием искусственной (синтетической) дзРНК.
Из табл.1 видно, как применение неспаренной дзРНК на самом деле приводит к поразительному снижению уровня HIV в сыворотке крови подвергнутых лечению больных.
Обнаружено, что активирование PHазы L коррелирует с содержанием HIV и с клиническими улучшениями. Спаренная дзРНК может оказаться приемлемой и дозировки могут быть достаточно низкими, чтобы избежать нежелательных реакций, таких как поли I. Поли C (дзРНК приготовлена Lampson). Там, где возможно применение более высоких дозировок, необходимость в применении дзРНК будет гораздо большей.
Рекомендуют, чтобы дзРНК была способна давать необходимые высокие концентрации 2'-5' А-оригомеры для вытеснения ингибитора PHазы L без токсического действия, например, вследствие ускоренной биодоступности структуры, приспособленной активировать продуцирование 2'-5'-олигомеров без побочных эффектов, или вследствие сравнительно короткого периода полураспада после приема.
Неспаренная двунитевая РНК является известной формой макромолекулярной РНК, в которой дестабилизацией двойной спирали не допускают базового сваривания. Неспаренная РНК хорошо известна за свою способность индуцировать интерферон, что указывает на механизм, не связанный с индуцированием как таковыми интерферона.
Типичным лечебным воплощением неспаренной двунитевой РНК является синтетическая дзРНК, образованная комплексом полирибоинозиновой и полирибоцитидиловой-уриловой кислоты, такой как rInr (Cx; V или G), где x принимает значения от 4 до 29, например, rIn. (C12V)n, далее называемый "Амплигеном". Исследованы многие полимерные дзРНК, по своему поведению аналогичные Амплигену. Ключевое лечебное преимущество неспаренных РНК по сравнению с другими формами природных и/или синтетических РНК заключается в их низкой токсичности по отношению к животным и человеку.
Известны комплексы дзРНК на ранних стадиях образования, способные запускать в действие различные, связанные с интерфероном, эффекты, однако токсичность таких соединений исключает какое-либо клиническое их применение для лечения рака или аналогичных нарушений.
Изобретателем в полной мере описаны известные виды активности различных интерферонов, индукторов интерферонов и дзРНК в недавно вышедших справочных изданиях, посвященных данному вопросу (см., например, написанную изобретателем главу в книге Противораковые и интерферонные средства, с. 301-319, под ред. R. M.Ottenbrite и G.B.Butler, Марсель Деккар, Нью-Йорк, 1984 г.; см. также "Справочник экспериментальной фармакологии по интерферонам", под ред. P. E.Come и W.A.Carter 1984 г., изд. Шпрингер-Ферлаг, Нью-Йорк и Гейдельберг, с. 533-555, где полностью описаны известные свойства дзРНК).
Как сейчас известно, дзРНК, например Амплиген, обладают терапевтической активностью против определенных опухолей человека, в частности, рака почки. Хотя существующее в настоящее время мнение отводят дзРНК роль только "индукторов интерферона", тем не менее дзРНК проявляют активность по отношению к определенным опухолям человека, полностью устойчивых к действию интерферона.
Также изобретатель описывает ингибирование HIV в культуре клеток человека с помощью дзРНК при использовании Амплигена в качестве прототипа дзРНК.
Термин "неспаренная дзРНК" подразумевает, что водородные связи (укладка оснований) между противостоящими нитями (дзРНК остаются сравнительно интактными, т.е. прерываются менее чем одной парой оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Именно так и следует понимать термин "неспаренный дзРНК".
дзРНК может представлять собой комплекс полиинозината и полицитидилата, с определенным отношением урациловых оснований или гуанидиновых оснований, например, от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли I. поли (С4-29x > V или G). дзРНК может отвечать формуле Поли I. Поли С, где отношение С и V примерно 13 к 1 и коэффициенты осаждения как для Поли I, так и для Поли С, менее 9 и в пределах 2 единиц друг от друга, предпочтительно для обоих примерно 0,5-7,5.
дзРНК может отвечать общей формуле rIn. (С12xV)n. Другие приемлемые примеры дзРНК обсуждаются ниже.
Композиция может включать дзРНК и средство, помогающее ингибировать HIV, такое как лимфонин, например, интерферон или интерлейкин, такой как IL-3. В табл.2 приведены различные комбинации композиций. Недостаток PHазы L или недостаток другого аналогичного зависимого от дзРНК фермента будет виден в различных клетках больных СПИДом, в том числе T-клетках, ЕУ-клетках, АЛУ-клетках, лимфоцитах и моноцитах (см. табл.2).
Как поясняется в настоящем описании, дзРНК может рассматриваться в качестве базового биологического средства для лечения и коррекции некоторых вызванных HIV нарушений. В табл.2 приведено семь специфичных для HIV дефектов или нарушений, которые приведены в сочетании с соответствующими потенциальными лечебными комбинациями дзРНК в смеси с другим лечебным средством или средствами.
Неспаренные дзРНК, рекомендуемые для использования в изобретении, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди поли (Cx, V) и поли (Cx, G), где x означает цифровой показатель, принимающий значения от 4 до 29, и являются неспаренными аналогами комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитилиновой кислот, образованных модифицированием rIn-rCn введением неспаренных оснований (урацил или гуанидин) вдоль нити полирибоцитидилата (rCn). Или же дзРНК может происходить из поли (I), поли (С) дзРНК модифицированием рибозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (rIn), например, путем включения 2'-0-метилрибозильных остатков. Такие неспаренные аналоги rIn. rCn, из которых предпочтительны отвечащие общей формуле rI. (C12,V)n, описания которых даются в качестве ссылок. Описанные в этих ссылках дзРНК, как правило, приемлемы для использования согласно изобретению.
Специфичные примеры неспаренных дзРНК, предназначенных для использования в изобретении, включают:
поли (I). поли (C4,V)
поли (I). поли (С7,V)
поли (I). поли (C13,V)
поли (I). поли (C22,V)
поли (I). поли (C20,G)
поли (I). поли (С29,С) и
поли (I). поли (Cp) 23G > p.
Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением включают неспаренную дзРНК, возможно также интерферон или другие иммунные модуляторы (лимфонин) в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Фармацевтические композиции, рассматриваемые изобретением, включают композиции, приспособленные для парентерального введения в приемлемом фармацевтическом носителе.
Например, парентеральные растворы, суспензии или дисперсии могут быть приготовлены согласно известным фармацевтическим приемам со стерильной водой или несодержащей пирогенов водой в качестве растворителя разбавителя, возможно также в смеси с физиологически приемлемыми солями .
Количество вводимой неспаренной дзРНК предпочтительно достаточно для достижения пиковой концентрации в крови от 0,01 мкг на 1 мл дзРНК до 1000 мкг на 1 мл в систематической системе кровообращения в точке, удаленной от места вливания, сразу же после введения. При сопутствующем введении интерферона его предпочтительно включают в количестве, которое приводит к уровню в 0,1-100000 IRV на миллилитр жидкости организма. Как правило, вводимое количество зависит от тяжести симптомов, в частности, уровня доступной внутриклеточной биоактивной дзРНК, молекул 2'-5'-олиго А или 2'-5'-А-синтетазы и относительного уровня ингибирования PHазы L. В используемом здесь значении термин жидкость организме означает раствор сыворотки, витаминов и т.д., который циркулирует в организме и смывает ткани. Ожидаемые объемы жидкости организма больного, разумеется, известны практикам и опубликованы в виде диаграммы и таблиц, которые доступны в обычном порядке. Средний объем жидкости в организме составляет примерно 5-6 л.
Изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами использования дзРНК.
Неспаренную дзРНК, например Амплиген, приготавливают в виде водного раствора таким образом, что при добавлении к различным клеткам человека получают переходные концентрации жидкости (для промывания клеток) в 0,01-250 мкг на 1 мл. Использован ряд клеток - потенциальных мишений для инфекции HIV.
Далее описан типичный эксперимент с Н-9 клетками-лимфоидными клетками человека, которые могут быть остро или хронически инфецированы HIV. Клетки выращены в стандартных условиях (см., например, Mitsuya и др., Sciencе, т. 226, с. 172, 1984 г.) и анализируют несколько недель на предмет присутствия ферментов HIV или специфичных для HIV белков. Амплиген добавляют в различных концентрациях до, после или одновременно с добавлением вируса, тем самым имитируя различные клинические состояния. Что наиболее важно, был проведен тщательный анализ числа клеток, морфологии и т.д. с целью определения оказывает ли неспаренная дзРНК различное неспецифическое действие на рост лимфоидной клетки, как было описано Mitsuya, вместе с другими ингибиторами. Клетки в различные моменты эксперимента выделяют и исследуют с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) на присутствие 2'-5'-A-олигомеров по методике, описанной Lee и др. Biochemistry, т.24, с. 551, 1985 г.). Определенные А-олигомеры, присутствующие в природе, как известно, придают клеткам устойчивость к вирусам, однако ранее не было описано и не предполагалось, что испытуемое соединение (синтезированное человеком) может точно вводить в действие такую природную реакцию селективно, тем самым усиливая природный защитный механизм против вирусов в целом и в частности против HIV. Действие Амплигена на инфекционность HIV приведено в табл.3.
Эксперимент А проведен при 25-кратном превышении вируса (выраженного в виде инфекционных единиц) по сравнению с клетками-мишенями, в то время как эксперимент В проведен при 10-кратном превышении клеток-мишеней (обозначены как Н-9 клетки) по сравнению с вирусом. Процент положительных клеток приведен по отношению к клеткам, которые экспрессируют маркеры HIV, обозначенные при p24 и p19 на основании иммуннофлуоресцентного анализа в клеточном центрифугате по стандартной методике, и обозначена как rA/dT. Одновременно проводят подсчет клеток: клетки мультиплицируются с нормальными скоростями роста при всех испытанных концентрациях Амплигена (вплоть до 300 мкг на 1 мл). В экспериментах A и B Амплиген (50 мкг на 1 мл) добавляют на 1-й день. ВЭЖХ-анализ показал (на 3-7 день в опытах A и B) специфичное смещение в распределении 2'-5'-олигомера таким образом, что олигомеры с более высоким молекулярным весом (МB) (менее противовирусные) смещены к олигомерам с более низким MB (более противовирусные), вносящих вклад в селективное и сильное подавление HIV. Одновременно определение PHазы L указывает на восстановление PHазы L при последовательной обработке ДзРНК.
Аналогичные опыты проведены и с другими различными клетками человека, являющимися потенциальными in vivo мишенями для HIV. В этих опытах использованы клетки, функционально определенные как КУ-клетки (естественные клетки-убийцы). Т-клетки фага-помощника, Т-клетки подавителя, моноядерные клетки и т.д. Во всех случаях неспаренная дзРНК в различных концентрациях оказывалась способной селективно прекращать и/или предотвращать мультипликацию HIV без какого-либо воздействия на рост и созревание нормальных клеток (см. табл.2). Пролиферацию Т-клеток в культуре устанавливают стандартным добавлением IL-2 фактора, т.е. хорошо известным в биологии клетки способом. Селективное подавление HIV с помощью неспаренной дзРНК устойчиво связано со специфическим смещением или усилением в распределении 2'-5'-олигомера, что установлено ВЗЖХ-анализом.
В соответствующих биохимических процессах дзРНК участвуют в нисходящем направлении или в местах, отдаленных от мест биохимических нарушений у индивидуумов группы риска (активно инфецированных или неинфецированных HIV), тем самым восстанавливает нормальную способность противостоять вирусам.
дзРНК очень эффективно воспринимается клетками, вследствие чего не требует интактных рецепторов интерферона. Кроме того, неспаренная дзРНК также существует в виде биоактивных фрагментов, что ускоряет внутриклеточное усвоение и распределение. Таким образом, дзРНК обладает потенциалом, позволяющим легко преодолеть барьер между кровью и мозгом, который может служить остаточным резервуаром HIV у отдельных индивидуумов.
Как правило, используемая в изобретении дзРНК имеет известные размеры молекулы, однако дзРНК с более низким молекулярным весом, получаемые в виде фрагментов родственных молекул, тоже эффективны. Такие фрагменты могут составлять, например, от половины до одной десятой размера типичного материала дзРНК, описанного ранее.
дзРНК активирует 2'-5' А-полимеразы и промотирует синтез 500-кратного прироста активных противовирусных олигонуклеотидов по сравнению с применяемым отдельно интерфероном (дзРНК дает до 250 наномоль 2'-5'-олиго A в 1,6 ˙ 108 клетках, в то время 200 единиц/мл интерферона дают только 0,5 наномоль 2'-5'-олиго А).
Аналогичное явление заявитель наблюдал в ЕУ-клетках индивидуумов с риском заболеть СПИДом или с явными признаками СПИДа. Аналогичная ситуация существует по отношению к уровню активности естественных клеток-убийц больных РСК-СПИДом. Однако гораздо меньше известно относительно механизма регуляции ЕУ-клеток. Больные РСК-СПИДом и здоровые члены группы риска часто обладают слабой способностью к иммунному контролю (функциональные ЕУ- и Т-лимфоциты) и не могут быть реактивированы интерфероном. Амплиген действует в стороне от блока болезни и способен активировать цитотоксичные лимфоциты.
Использование: изобретение относится к области медицины, а именно к клинической биохимии и касается способа воздействия на развитие заболевания, вызванного HIV-вирусом или вирусом, вызывающим сходную биохимическую или клиническую картину. Цель изобретения: повышение эффективности. Сущность изобретения заключается в определении РНК-азы L в экстракте моноядерных клеток периферической крови больного посредством определения продуктов расщепления 28 - pНК и 18 - S рРНК и биоактивных 21-51 А-олигомеров, и если активированная РНК - L не обнаружена, вводят Амплиген® в дозе 50 - 250 мг с частотой, достаточной для достижения в крови концентрации дзРНК 0,01 - 1 мкг/мл. Положительный эффект заключается в повышении эффективности выздоровления. 3 табл.
СПОСОБ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА РАЗВИТИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО HIV-ВИРУСОМ ИЛИ ВИРУСОМ, ВЫЗЫВАЮЩИМ СХОДНУЮ БИОХИМИЧЕСКУЮ ИЛИ КЛИНИЧЕСКУЮ КАРТИНУ, путем определения биохимических показателей и введения лекарственного препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, определяют присутствие или отсутствие активированной РНК-азы L в экстракте моноядерных клеток периферической крови больного путем измерения продуктов расщепления 28-р РНК и 18-s рРНК и биоактивных 21 - 41-олигомеров, и если активированная РНК-азаL не обнаружена, вводят Амплиген в дозе 50 - 250 мл с частотой, достаточной для достижения в крови концентрации дзРНК 0,01 - 1 мкг/мл, причем Амплиген представляет комплекс полиинозита и полицитидилата, содержащий от 1 в 5 до 1 в 30 оснований урацила и гуанина, преимущественно формулы rIn · r(C12U)n и продолжают его введение до улучшения или стабилизации клинических симптомов.
| H | |||
| Chart, Newsweer | |||
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
