Штамм SтRертососсUS LастIS - продуцент антибиотика низина Советский патент 1991 года по МПК C12P21/00 C12N1/20 

Ё

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской, микробиологической и консервной промышленности Целью изобретения является штамм продуцент низина, обеспечивающий высокий выход целевого продукта при сокращении сроков ферментации и расширении спектра сбраживаемых субстратов. Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-4591 является рекомбинантным, полученным при слиянии протопластов низкоактивных по низину родственных штаммов 729 и 1605, полученных из коллекции культур микроорганизмов ВНИКМИ. Штамм обладает высокой антибиотической активностью низина в культу- ральной жидкости, позволяет сократить время процесса получения низина и обеспечивает возможность замены глюкозы на другой углеводный субстрат. 2 табл

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов и может быть использовано в пищевой, молочной, медицинской, микробиологической и консервной промышленности.

Целью изобретения является штамм - продуцент низина, обеспечивающий высокий выход целевого продукта при сокращении сроков ферментации и расширении спектра сбраживаемых субстратов.

Штамм Streptococcus lactls F116 хранится в музее чистых культур ВНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В-4591. Штамм является рекомбинантным, полученным при слиянии протопластов низкоактивных по низину родственных штаммов 729 и 1605, полученных из коллекции культур микрорганизмов ВНИКМИ Госаг- ропрома СССР.

Морфологические признаки. Грамполо- жительные бактерии, бесспоровые, неподвижные, клетки сферической формы до 2 мкм в диаметре, образующие пары или цепочки до четырех кокков. На агаровых средах образуют белые блестящие колонии с ровными краями, мелкие с диаметром до 3 мм (поверхностный рост). Возможен глубинный рост на твердых агаровых средах, при этом вырастают колонии лодочкообразной формы. Характер роста на агаровых средах с добавлением гидролизата молока, капустного отвара, дрожжевого автолизата в сочетании с солями или МПА идентичен,

Культуральные признаки. При росте в жидких средах, приготовленных на основе гидролизата молока, глюкозодрожжевой с солями наблюдается помутнение, в стерильном обезжиренном молоке образуется плотный сгусток. В мясопептонном бульоне (МПБ) с 2-4% хлористого натрия наблюдаО 00

VI

Ок

сЈ

ется рост, а с 6,5% хлористого натрия рост отсутствует, а гидролизате молока с рН 9,2 растет, а при рН 9,6 нет. Штамм термоустойчив при 55°С, но прм 45°С не растет, как и при температуре ниже 10°С. Оптимальной температурой инкубирования является 25°С.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм образует аммиак из аргинина, сбраживает арабинозу, галактозу, маннозу, глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу, рафинозу, сорбит, мэннит, декстрин. Является типичным представителем гомофер- ментативного молочно-кислого брожения. При росте образует до 4,0% молочной кислоты, следовые количества диацетила и аце- тоина (по креатиновой пробе), за 8-9,5 ч инкубирования - полипептидный антибиотик низин с активностью его в культураль- ной жидкости до 4000-4200 ME/мл. Штамм устойчив к низину, фузидину, рифампицину, неомицину, пенициллину, фагоустойчив, не патогенен. Высокая активность штамма стабильна в течение 22 генераций и при длительном хранении в пиофильном состоянии в ампулах с защитной средой, содержащей, %: желатоза 11; сахароза 22, глютамат натрия 4,4; цитрат натрия трехзамещенного 50,0, при 4-6°С; в течение месяца штамм можно хранить а условиях холодильника в виде молочного сгустка. Перевивку производят посредством внесения сгустка с одной микробиологической петли в стерильное обезжиренное молоко (8-10 мл). Засеянный инокулят выращивают при 22-25°С в течение 10-12 ч.

П р и м е р 1. Использование штамма Streptococcus lactis F 116.

Штамм восстанавливают в стерильном обезжиренном молоке и инкубируют при 25°С до образования сгустка. Микробиологической петлей сброженный культурой молочный сгусток вносят в 10 мл стерильного обезжиренного молока и инкубируют 8 ч. Затем тем же способом сгусток вносят в посевную промежуточную среду состава: глюкоза 1%; дрожжевой автолизат 25 мг% по азоту аммония. После 8-9 ч инкубирования 3% инокулята переносят из посевной среды в солевую среду, содержащую, %: глюкоза 1; К2НР04 2,0; NaCI 20,2; MgSCU 0,02 и дрожжевой автолизат в том количестве, что и в посевной среде. Процесс ферментации ведут 8-9,5 ч при комнатной температуре, что обеспечивает антибиотическую активность культуральной жидкости на уровне 4000 МЕ/мл.

П р и м е р 2. Штамм, восстановленный в стерильном обезжиренном молоке, после инкубирования в промежуточной посевной среде состава по примеру 1, высевают в

солевую среду, содержащую, %: мальтоза 1,0; остальные компоненты - в том же количестве. Уровень антибиотической активности при тех же режимах составляет 4200 МЕ/мл.

Антибиотическую активность определяют микробиологическим методом с тест- культурой Вас. coagulans. Среду для культиЁирования теста готовят на бульоне Хоттингера с добавлением, %: глюкоза 1,0;

NaCI 0,2; агар-агар 2,0. Для титрования антибиотика низина служит среда, приготовленная на фосфатном буфере с рН 5,0 с добавлением, %: пептон 2,0; глюкоза 1,0; агар 2,0.

Ход определения. Культуральную жидкость вместе с биомассой стрептококков экстрагируют ацетоуксусной смесью в соотношении ацетон:кислота:вода 4:1:5 при 55°С в течение 1 ч. Для этого 0,5 мл культуральной жидкости разводят в 4,5 мл смеси, ставят на экстракцию, полученный экстракт разводят фосфатным буфером в соотношении 1:10 и 0,12 мкл, вносят в лунки на агаровой среде, засеянной тест-культурой. По

зонам ингибирования роста теста за 14 ч роста определяют антибиотическую активность экстрактов в пересчете по калибровочной кривой, полученной при титровании растворов стандартного препарата Nlsaplln

фирмы Aplln and Barret (Англия), содержащего 5, 10, 15, 20 мкг/мл чистого низина.

В табл.1 приведены сравнительные данные антибиотической активности и процесса ферментации предлагаемого и известного штаммов.

В табл. 2 приведены генетические особенности предлагаемого и известного штаммов.

Использование предлагаемого штамма

по сравнению с известным имеет следующие преимущества:

высокая антибиотическая активность низина в культуральной жидкости;

сокращение времени процесса получения целевого продукта:

возможность замены основного углеводного субстрата (глюкозы на мальтозу или другой утилизируемый углеводный субстрат).

Формула изобретения

Штамм Streptococcus lactis ВКПМ В-4591 - продуцент антибиотика низина.

Таблица 1

Таблица 2