Способ диагностики аллергии Советский патент 1993 года по МПК G01N33/53 

- Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии, и может быть использовано для выявления заболеваний аллергического ге неза у детей.

Цель предлагаемого способа - повышение точности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

Утром натощак у больного из вены или из пальца берут 1 мл крови в пробирку. Пробирку оставляют р при комнатной температуре на 1-1,5 часа до образования сгустка, затем пробирку центрифугируют 15 мин при 1500 об/мин, сыворотку крови от- сасывают и разливают на 3 пробы: проба А - 0,05 мл сыворотки крови, проба В - 0,1 мл сыворотки, проба С -0,1 мл сыворотки. Пробу С прогревают при 56°С в течение 4 ч, а затем все три пробы замораживают и хранят до момента исследования при -20°С в . морозильной камере.

1. Этап исследования - измерение уровня IgE в пробе А (осуществляют в полном соответствии с инструкцией по применению тестсистемы, иммуноферментной для определения общего IgE человека, Ставропольского НИИ вакцин и сывороток), следующим образом; 1. Пробу А, содержащую 0,05 мл свежей сыворотки крови больного размораживают и разводят раствором № 1 (прилагается к набору для определения IgE) 1:10, т.е. к 0,05 мл исследуемой сыворотки прибавляют 0,45 мл раствора № 1.

2. Инкубация со стандартом IgE и исследуемыми образцами. Освобождают планшет, прилагаемый к набору для определенияIgE, от упаковки и маркируют. В кажду лунку 1 ряда планшета по вертикали вносят по 0,2 мл раствора № 1 (прилагается к набору для определения IgE) в качестве отрицательного контроля. В лунки А и В второго и третьего ряда вносят по 0,2 мл стандарта IgE (прилагается к набору) с

Ё

00

о

СлХ 00

хг 00

содержанием 100 кЕ/л положительный контроль). Затем в лунки В, С, D и т.д. этих рядов вносят по 0,2 мл раствора № 1. Содержимое лунок В тщательно перемешивают с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость. После перемешивания содержимое лунок В второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл последовательно переносят в лунки С, из лунок С - в лунки D и т.д. и т.д., каждый раз аналогично перемешивая и осуществляя таким образом двухкратное разведение стандарта IgE от 100 кЕ/Л до концентрации/0,8 кЕ/л. Йз последних лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. Во все другие лунки вносят по 0,2 мл исследуемых сывороток (проба А разведения 1:10) в дубликатах. Планшет плотно закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре 37°С на 1 час для образования комплекса антиген-антитело.

3. Отмывка планшета. Планшет вынимают из термостата, жидкость из лунок удаляют отсасыванием с помощью пипетки Пастера и водоструйного насоса. Затем каждую лунку доверху заливают раствором № 1 (прилагается к набору для определения IgE (на 2-3 мин., жидкость вновь удаляют. Всю процедуру промывания повторяют не менее 3 раз. По окончании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения.

4. Инкубация с ко.ньюгатом. В каждую лунку планшета вносят по 0,2 мл раствора конъюгата NN 3 (прилагается к набору для определения IgE), планшеты закрывают крышкой и помещают в термостат при 37°С на 1 час. .

5. Отмывку планшета проводят в пункте 3, повторив процедуру не мене 5 раз.

6. Приготовление субстратной смеси и инкубация-планшетов, Субстратную смесь готовят ex tempore. На 3 планшета к 60 мл раствора № 5 добавить 0,06 мл раствора № 6 (реактивы для растворов № 5 и № 6 припа- гаются к набору для определения IgE) и тща- тельно перемешивают стеклянной палочкой. В каждую лунку отмытых планшетов вносят по 0,2 мл свежеприготовленной Субстратной смеси. Инкубируют в течение 20-30 мин., в зависимости от интенсивности окрашивания, при комнатной температуре в защищенном от света месте. В лунках планшета, где прошла реакция, появляется желток окрашивание разной интенсивности. Лунки первого контрольного ряда должны оставаться бесцветными. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50% раствора -серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности

стандарта IgE в 100 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.

7. Учет результатов. Фотометрическая оценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводят на фотометре Tltertek Multlskan MC при длине волны 492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет показаний оптической плотности контрольного 1 ряда планшета из показаний оптической плотности исследуемых образцов. Анализ считывается действительным если:

-ни один из показателей отрицательного контроля не превышает оптическую плот- 5 ностьО,1;

- показатели максимального положительного контроля (стандарт 1дЕ в 100 кЕ/л превышает оптическую плотность е 1,0. Для каждого разведения стандарта IgE

0 определяют среднюю величину показателя оптич.еской плотности, На графике, построенном на маштабно-координатной бумаге марки ПЛН (прилагается к набору для определения IgE) по оси абсцисс откладывают

5 значения стандартов IgE, а по оси ординат - показатели оптической плотности. На основании средних показателей оптической плотности, определенных для каждого стандарта, строят калибровочную кривую.

0По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности каждого образца вычисляют концентрацию IgE в пробе А (свежая сыворотка больного, разведенная 1:10) с учетом разведения. Пол- 5 ученный результат сравнивают с возрастными нормами IgE/M + 1G). Если полученный результат превышает возрастную норму IgE, на этом исследование прекращают, а если уровнеь IgE в исследуемой сыворотке

0 находится в пределах возрастной нормы, проводят 2 этап исследования. 2 этап исследования - измерение соержания IgE в свежей сыворотке (проба В) и смеси свежей и прогретой сыворотки (проба В) и смеси

5 свежей и прогретой сыворотки (проба В + проба С). Размораживают пробы В и С. В отдельной пробирке готовят смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирают 0,05 мл сыворотки из из пробы С

0 отбирают 0,05 мл сыворотки, перемешивают их и доливают 0,4 мл раствора № 1 (прилагается к набору для определения IgE) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составляло 1:10. К оставшимся 0,05

5 мл свежей сыворотки в пробе В и к 0,05 мл сыворотки в пробе С добивают по 0,45 мл раствора № 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10), Измеряют содержание IgE в пробах В, С и В+С так же, как на 1 этапе исследования, т.е. повторяют пункты 1-7

первого этапа . В пробе С содержание IgE должно равняться нулю. Определяют процент связывания IgE прогретой сывороткой по формуле:

юо- Bi-(B+c)

в

х 100 %f

где В - содержание IgE в свежей сыворотке (проба В), В + С - содержание IgE в смеси свежей и прогретой сыворотки (проба б+проба С), Аллергию диагностируют, если содержание IgE в смеси свежей и прогретой сыворотки по сравнению со свежей сывороткой снижается менее чем на 10%, не изменяется или повышается.

С использование предлагаемого способу было обследовано 139 детей с различными аллергическими заболеваниями (бронхиальная астма, астматический бронхит, аллергический ларинготрахеит, полли- ноз, экзема, нейродирмит, крапивница), у которых аллергия подтверждена кожными (скарификационными) и провокационными тестами с различными аллергенами (домаш- нйя пыль, пыльца растений, эпидермальные и пищевые аллергены). Эти же больные были обследованы также с использованием сг)особа-прототипа. Результаты сравнения точности предлагаемого способа и способа- прототипа представлены в таблице.

Из данных таблицы видно, что использование заявленного способа позволяет повысить точность диагностики на 40% по сравнению со способом прототипом.

П р и м е р 1. Больная Таня Ш., 1 г 9 мес., поступила для обследования в детскую борьницу N 1 г. Ленинграда 7.01.89 г. с диргнозом рецидивирующий обструктив- ныи бронхит. Из анамнеза известно, что девочка больна-с декабря 1987 г., когда на фойе острого респираторно заболевания появилась экспираторная одышка, сухой, навязчивый кашель. Лечилась антибиотиками, отхаркивающими средствами, но одышка, кафель, сухие хрипы в легких на фоне нормальной или субфебриальной температуры рецидивировали каждые 1-2 месяца. 8..89 г. взята кровь для определения содержания IgE. Сыворотку крови больной распределяли на 3 пробы: проба А-0,05 мл сывйротки крови, проба В - 0,1 мл сыворотки, проба С - 0,1 мл сыворотки пробу С прогрели при 56°С в течение 4 часов, затем все три пробы заморозили и хранили до момента исследования при -20°С в моро- зилЬной камере. Исследование IgE проведено 10.01.89 г,

I этап исследования - измеряли уровень IgE в пробе А следующим образом.

1. Пробу А, содержащую 0,5 мл свежей сыворотки крови больной разморозили и развели раствором № 1 (прилагается к набору для определения IgE Ставропольского 5 НИИ вакцин и.сывороток) 1:10, т.е. к 0,05мл исследуемой сыворотки прибавили 0.45 мл раствора Ms 1.

2. Инкубация со стандартом IgE и исследуемым образцом. Освободили планшет,

0 прилагаемый к набору для определения IgE, от упаковки и примаркировали. В каждую лунку 1 ряда планшета по вертикали внесли по 0,2 мл раствора № 1 (прилагается к набору для определения IgE) в качестве отрица5 тельного контроля, В лунки А и В второго и третьего ряда внесли по 0,2 мл стандарта IgE (прилагается к набору) с содержанием 100 кЕ/л (положительный контроль). Затем в лунки В, С, D и т.д. этих рядов внесли по

0 0,2 мл раствора № 1. Содержимое лунок В тщательно перемешали с помощью пипетки, 5 раз набирая и сбрасывая жидкость. После перемешивания содержимое лунок В второго и третьего ряда в количестве 0,2 мл

5 последовательно перенесли в лунки С, из . лунок С - в лунки D и т.д., каждый раз аналогично перемешивая и осуществляя таким образом, двухкратное разведение стандарта IgE от 100 кЕ/л до концентрации 0,8

0 кЕ/л. Из .последних лунок лишние 0,2 мл содержимого отбрасывают. В две другие лунки внесли по 0,2 исследуемой сыворотки (проба А, разведенная 1:10). Планшет плот- но закрывают крышкой и помещают в тер5 мостат при температуре 37°С на 1 час для образования комлекс-саа нтиген-антитело.

3. Отмывка планшета. Планшет забрали из термостата, жидкость из лунок удалила отсасыванием с помощью пипетки Пастера

0 и водоструйного насоса. Затем каждую лунку доверху залили раствором № 1 (прилагается к набору для определения IgE) на 2-3 мин, жидкость вновь удалили. Всю процедуру промывания повторили 3 раза. По окон5 чании отмывки планшет кладут на фильтровальную бумагу вверх дном для осушения,

4. Инкубация с коньюгатом, В каждую лунку планшета внесли по 0,2 мл раствора 0 коньюгата № 3 (прилагается к набору для определения IgE). планшеты закрыли крыш- кой и поместили в термостат при 37°С на 1 час.

5. Отмывку планшета проводили, как 5 описано в пункте 3, повторив процедуру 5

раз,

6. Приготовление субстратной смеси и инкубация планшетов. Субстратную смесь готовили ex tempore. к 60 мл раствора № 5 добавили 0,06 мл растора № 6 (реактивы для

растворов Ms 5 и № б прилагаются к набору ля определения IgE) и тщательно перемешали стеклянной палочкой. В каждую лунку отмытых планшетов внесли по 0,2 мл свежеприготовленной субстратной смеси. Инку- 5 бировали в течение 20 мин, при комнатной температуре в защищенном от света месте, В лунках планшета, где прошла реакция, появилось желтое окрашивание разной интенсивности. Лунки первого контрольного 10 ряда остались бесцветными. Реакцию остановили добавлением в каждую лунку 0,05 мл 50% раствора серной кислоты, предварительно убедившись в том, что показания оптической плотности стандарта FgE в 100 15 кЕ/л находятся в пределах 0,5-1,0.

7. Учет результатов. Фотометрическая оценка. Измерение поглощения света окрашенными растворами проводили на фотометре Titertek Multlscan MC при длине 20 волны 492 нм, установив режим прибора на автоматический вычет показаний оптической плотности контрольного первого ряда планшета из показаний оптической плотности исследуемых образцов. Анализ считался 25 действительном, т.к. ни один из показателей отрицательного контроля не превышал оптическую плотность 0,1, а показатели максимального положительного контроля (стандарт IgE в 100 кЕ/л) превышал оптиче- 30 скую плотность в 1,0.

Построение калибровочной кривой. Для каждого разведения стандарта IgE определяли среднюю величину показателя оптической плотности. На графике, построенном 35 на масштабно-координатной бумаге марки ПЛН по оси абсцисс откладывали значения стандартов IgE, а по оси ординат - показатели оптической плотности. На оснований средних показателей оптической плотно- 40 сти, определенных для каждого стандарта, построили калибровочную кривую. По калибровочной кривой на основании среднего показателя оптической плотности образца А сыворотки, поставленного в дубле, вычис- 45 лили концентрацию IgE в пробе А с учетом разведения 1:10. Концентрация IgE в свежей сыворотке крови больной Тани Ш. 1 года 9 месяцев составила 16 кЕ/л. Возрастная норма IgE в этом возрасте составляет 23 50 кЕ/л (MIG), т.е. содержание IgE в сыворотке крови данной больной находится в пределах возрастной нормы и по прототипу такая больная не входит в группу больных аллергическими заболеваниями. Поскольку уро- 55 ве.нь IgE в сыворотке данной больной находился в пределах возрастной нормы, был проведен второй этап исследования - измерение содержания IgE в свежей сыво- ротке той же больной (проба В) и в смеси

свежей и прогретой сыворотки (проба В + проба С). Разморозили пробы В и С. В отдельной пробирке приготовили смесь свежей и прогретой сыворотки, для чего из пробы В отбирали 0,05 мл сыворотки и из пробы С отбирали 0,05 мл сыворотки перемешивали их и доливали 0,4 мл раствора № 1 (прилагается к набору для определения IgE) с тем, чтобы конечное разведение свежей сыворотки составило 1:10. К оставшимся 0,05 мл свежей сыворотки в пробе В и К 0,05 мл прогретой сыворотки в пробе С доливали, по 0,45 мл раствора № 1 (конечное разведение обеих сывороток 1:10). Измеряли содержание IgE в пробах В, С, В+С так же, как на В пробе С содержание IgE равнялось нулю, в пробе В было равным 16 кЕ/л, в пробе В+С - 15 кЕ/л. Определили процент связывания IgE прогретой сывороткой по формуле:

100- S-(g+C) -хЮО.%,В

что было равно 100 16 -15 16

х 100%

6%, т.е. прогретой сывороткой связывалось только 6% IgE, содержащегося в свежей сыворотке. По данным заявленного способа данная большая входила в группу больных аллергическими заболеваниями, что было впоследствии подтвреждено положитель-. ными скарификационными тестами с аллергенами домашней пыли) домашняя пыль серии 268+++, домашняя пыль серии 216+++) и положительным эффектом от проведенного курса специфической игипосен- сибилизации (при наблюдении в течение года после проведенного курса гипосенси- билизации у девочк.и зарегистрировано только два непродолжительных эпизода бронхиальной обструкции - в течение 1-2 дней, которых легко снималась приемом водной микструры с эуфиллином).

История больной Тани Ш, Ns 314.

П р и м е р 2. Больной Филипп М., 13 лет, поступил для обследования в аллергологи- ческое отделение детской больницы N6 1, 3.04.89 г. (История болезни Nfe 4316) для обследования по поводу рецидивирующей крапивницы. Болен с 3 лет, когда впервые после перегрева на солнце появилась гене- рализованная крапивница, которая держалась в течение недели. В последующем проявления крапивницы отмечены при воздействии таких неспецифических факторов, как физическая нагрузка, переохлаждение, на фоне острых респираторных заболеваний. С помощью прототипа у больного измерено содержание общего IgE в сыворотке крови которое было равным 68 кЕ/л (возрастная норма - до 85 кЕ/л), т.е. по данным прототипа больной не входил в группу больных с аллергическими заболеваниями. При оценке содержания fgЈ в смеси свежей и прогретой сыворотки и в свежей сыворотке по заявленному способу оказалось, что содержащие IgE в свежей сыворотке и в смеси свежей и прогретой сыворотки было равным (68 кЕ/л). т.е. IgE не связывался прогретой сывороткой, что свидетельствовало в пользу аллергической природы заболевания у данного больного. При постановке кожных ска- рйфикационных проб выявлена сенсибилизация к облигатным пищевым аллергенам (белок куриного яйца +++, треска +++, апельсин +++, клубника +++). Рекомен- дорана гипоаллергенная диета, которую больной строго соблюдал. При наблюдений в течение года рецидивов крапивницы не отмечено.

ПримерЗ. Арсентий С.,11 мес. (история болезни № 8063)}поступил для обследования в и лечения в детскую больницу № 1 26.06.89 г. с диагнозом рецидивирующий средний отит. Болен с 2 мес., когда после перевода на искусственное вскармливание ежемесячно стал болеть отитами. Антибактериальная терапия была не эффективной. Заподозрен аллергический генеэ 3a6ojrie- вания. С помощью способа прототипа определен уровень сывороточного IgE, который был равен 11 кЕ/л (возрастная норма 13 кЕ/л), т.е. по данным способа-прототипа больной не страдал аллергическим заболеванием. С помощью предлагаемого способа определили содержание IgE в свежей сыворотке и в смеси свежей и прогретой сыворотки, которое было равно соответственно 11 КЕ/л и 13 кЕ/, т.е. в смеси свежей и прогретой сыворотки содержание IgE было выше, чем в свежей сыворотке и больной мог 0ыть отнесен к аллергологическим больным. Поставлены кожные пробы с аллергенами, которые оказались положительными с аллергенами коровьего молока +++ и с аллергеном белка куриного яйца ++. Перевод больного на безмолочную гипоаллергенную диету привел к стиханию симптомов отита. Под контролем отоларинголога была проведена провокационная проба с коровьим молоком, которая привела к возобновлению симпотов отита. После выписки из стационара больной строго соблюдал безмолоч- . ную диету, при наблюдении в течение 14 месяцев рецидивов отита не отмечено.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить точность диагностики

аллергии на 40% по сравнению со способом-прототипом за счет возможности выявления специфических для аллергии особенностей антигенной структуры молекулы IgE и наличия в сыворотке крови специфических для аллергии ингибирующих факторов. Способ может быть использован при скриннинговых массовых обследованиях для отбора деталей, подлежащих аллер- гологическому обследованию, а также при

сложностях дифференциальной диагностики аллергических и неаллергических заболеваний.

Формула изобретени я Способ диагностики аллергии путем определения содержания иммуноглобулина Е в свежей сыворотке крови больного, о т л и- ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа при обследовании детей, дополнительно лицам с нормальными показателями иммуноглобулина определяют содержащие иммуноглобулина Е в смеси свежей и прогретой при температуре 56°С в течение 4-х часов сывороток, взятых в соотношении 1:1 и при снижении его количества

менее, чем на 10% или отсутствии изменений, или повышении по. сравнению с показателями свежей сыворотки диагностируют аллергию.