Способ иммуноферментного определения миоглобина Советский патент 1991 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к иммуноферментным способам определения миоглобина в пробах крови.

Целью изобретения является сокращение времени анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

Для реализации способа используют меченый пероксидазой миоглобин. Для его получения к 4 мг предварительно активированной перйодатом натрия пероксидазы в карбонатном буфере рН 9,5 добавляют 8 мг миоглобина и инкубируют при постоянном перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре. Для стабилизации связи пероксидаза-миоглобин используют раствор боргидрида натрия с концентрацией 4 мг/мл. Инкубацию реакционной смеси в присутствии этого раствора проводят в течение 2 ч при 4°С. Очистку препарата осуществляют методом гель-хроматографии.

П р и м е р 1. Для анализа используют предварительно обработанный антителами к миоглобину в концентрации 2,5 мкг/мл и 1%-ной лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при температуре-15°С. В лунки планшета вносят по 25 мкл растворов миоглобина-стандарта (от 1,25 до 160 мг/мл), а затем-в те же лунки по 25 мкл меченого пероксидазой миоглобина в разведении 1:300. Одновременно в свободные лунки вносят анализируемую пробу сыво- ротки крови и меченный пероксидазой миоглобин в том же состоянии. Инкубацию смесей в планшете проводят в течение 10 Мин при 37°С. После отмывки водой лунки обрабатывают раствором казеина с концентрацией 0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,2. Затем определяют активность пероксидазы по общепринятой методике в присутствии хромогена 0 - фенилендиами- на при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строят ка(Л

С

о ю

«

4 СЛ СЛ

либровочную кривую и по ней рассчитывают концентрацию миоглобина в испытуемой сыворотке крови. Ее значение составляет 47,0 ± 1,35 нг/мл.

П р и м е р 2, Для анализа используют предварительно обработанный антителами к миоглобину в концентрации 3,75 мкг/мл и 1 %-ной лошадиной сывороткой полистири- ловый планшет, хранящийся притемперату- ре - 15°С. В дальнейшем определение миоглобина производят согласно примеру 1. Значение концентрации миоглобина в той же самой испытуемой пробе сыворотки крови составляет 46,3 ±1,44мг/мл.

Примерз. Для анализа используют предварительно обработанный антителами к миоглобину в концентрации 5,0 мкг/мл и 1 %-ной лошадиной сывороткой полистиро- ловый планшет, хранящийся при температуре-15°С. Затем определение миоглобина производят согласно примеру 1. Значение концентрации миоглобина в той же самой испытуемой пробе сыворотки крови состав- ляет47,2 ±1,12 нг/мл.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет уменьшить время определения миоглобина в 9 раз по сравнению с временем определения по прототипу.

В прототипе на определение миоглобина в пробе затрачивается 90 мин, а в предлагаемом способе только 10 мин.

Формула изобретения

Способ иммуноферментного определения миоглобина, включающий сенсибилизацию твердой подложки антителами, инкубацию ее с пробой, содержащей миог- лобин, и меченым пероксидазой хрена реагентом с последующим добавлением субстрата и по величине оптической плотности определяют концентрацию миоглобина в соответствии с калибровочной кривой, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения, в качестве реагента используют миоглобин, меченый пероксидазой хрена, причем подложку сенсибилизируют антителами в концентрации 2,5 - 5,0 мкг/мл и инкубируют одновременно с моченым миоглобином и исследуемой пробой в течение 10 мин.

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к иммуноферментным способам определения миоглобина. Цель изобретения - сокращение времени определения. Предварительно сенсибилизируют твердую подложку специфическими антителами в концентрации 2.5 - 5,0 мкг/мл, затем инкубируют одновременно с исследуемой пробой и меченым пероксидазой хрена ми- оглобином с последующей инкубацией в течение 10 мин. После чего добавляют субстрат и по величине оптической плотности определяют концентрацию в пробе миоглобина. По сравнению с прототипом уменьшается время определения миоглобина в 9 раз.