1М добавляют 1(И М гипоксэнтина, 4хЮ-7 М аминоптерина, 1,6x10 М тимидина. Наиболее продуктивные клоны выделяют по результатам пятенного иммуноферментно- го анализа (ИФА) и радиоиммуноанализа (РИА). Их оказалось два, один из которых обозначают 4D4.
Штамм 4D4 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Культура клеток состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток примерно одинаковой величины с крупными ядрами.
Культуральные признаки.
Среда для культивирования - 1М или ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл стрептомицина, 100 мкг/мл пенициллина. Клетки культивируются при 37°С в атмосфере 4-6% СОа. Посевная доза 0,2х106 кл/мл, клетки пассируют 1 раз в 2-3 дня, кратность рассева 1:5 (из плотности 10 кл/мл). Культура полусуспензионная, выращивается в пластиковых культуральных флаконах. Штамм продуцирует антитела на протяжении 50 пассажей в культуре.
Для выращивания штамма в асцитной форме клетки вводят в брюшную полость мышей линии BALB/c в количестве 10 кл на мышь. За 10-15 дней до прививания клеток мышь сенсибилизируют введением 0,5 мл пристана внутрибрюшинно. Асцит образуется через 10-15 дней. Асцитная жидкость забирается 2-5 раз через 1-2 дня. Общий выход асцитной жидкости 10-15 мл на мышь. Штамм перевивается с эффективностью не менее 80%.
Продуктивность штамма.
Титр антител в культуральной жидкости сохраняется неизменным на протяжении 50 клеточных генераций. Титр антител в асцитной жидкости 10 сохраняется неизменным на протяжении 4-х пассажей.
Характеристика полезного продукта.
Штамм синтезирует МА класса IgGI. Константа диссоциации иммунного комплекса составляет2,85x10 М. МА сохраняют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединениями редкоземельных металлов.
Контаминация штамма, i.
Бактерии и грибы в культуре не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.
Криоконсервирование.
Клетки замораживают нэ криопротек- торной среде, содержащей, %: 1М ДМЕМ 60; эмбриональная телячья сыворотка 7;
сыворотка крупного рогатого скота 23; ди- метилсульфоксид 10. Ампулы помещают в пенополистирольную закрытую коробку толщиной стенок 1 см, оставляют при -70°С
на 20 ч, затем переносят в жидкий азот. Размораживают при 37°С. Жизнеспособность после размораживания составляет 70%.
Штамм отличается от других близким
0 штаммов следующими признаками. Штамм 4D4 продуцирует монАТ, обладающие высокими константами связывания, которые не теряют способность к связыванию с Мч после модификации их хелатными соединени5 ями редкоземельных металлов, Эти свойства позволяют использовать монАТ в двухсайтных флуороиммунометрических тест системах на Мч. х П р и м е р 1. Получение штамма гибрид0 ных культивируемых клеток мыши Mus musculus, продуцирующего монАТ к Мч.
Мышам линии BALB/c вводят 100 мкл раствора Мч в концентрации 0,5 мг/мл в 100 мкл полного адьюванта Фрейнда. С интер5 валом в 3 недели проводят еще 2 инъекции в неполном э,аъюванте Фрейнда. За 4 дня до гибридизации водят 100 кмг Мч в 200 мкл физиологического раствора внутривенно. В следующие 2 дня повторяют инъекции внут0 рибрюшинно. Клетки селезенки иммунизированной таким образом мыши (10 клеток) объединяют с клетками миеломы мыши .653 (5x107 клеток) в присутствии 1 мл 40% полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол.м.
5 1000. После добавления ПЭГ реакционную смесь центрифугируют 3 мин (200д), супер- натант сливают, клетки ресуспендируют в 6 мл среды 1 М, содержащей 10% ЭТС, М гипоксантина, 4x10 М аминоптирина и
0 1,6x10 М тимидина. Гибриды-продуценты отбирают с помощью пятенного ИФАсупер- натантов их культур, На нитроцеллюлозные фильтры (0 пор 0,45 мкм) размером 4x4 мм с помощью микрошприца наносят Юнгочи5 щеного Мч в объеме 0,1 мкл. Для уменьшения неспецифического связывания фильтры инкубируют в растворе 0,02% желатина в буфере TBS (0.02M трис-HCI, рН 7,5, 0.15М NaClj. Обработанные таким образом фильт0 ры разносят по лункам 96-ячеечного планшета и инкубируют в течение 4 ч при комнатной температуре с 50 мкл суперна- тантов культуральной среды в разведении от 1:10 до 1:105. После инкубации фильтры
5 отмывают 3 раза в буфере и вносят по 50 мкл конъюгата антител козы против IgG мыши с пероксидазой хрена. После инкубирования в течение 1 ч при комнатной температуре фильтры отмывают описанным способом и связавшуюся пероксидазу, а
значит и антитела против Мч, детектируют по расщеплению субстрата (Н202) в присутствии хромогена - 4-хлор-1-нафтола. Присутствие антител определяется по наличию и степени окраски пятен фиолетового цвета. Для дальнейшей работы отобраны только высокопродуктивные и специфичные клоны по наиболее интенсивно окрашенным пятнам. Этих клонов всего два, их обозначают соответственно 8D6 и 4D4. Достовер- ное определение Мч методом пятенного ИФА достигается при разведении суперна- тантов культуры клонов 8D6 и 4D4 1:10 . Полученный штамм 8D6 вместе со штаммом ADA испытан в даухсайтном флуороимму- неметрическом анализе на Мч.
П р и м е р 2. Использование монАТ штамма 4D4 в двухсайтном флуороиммуно- метрическом анализе на миоглобин человека.
МонАТ выделяют из асцитных жидкостей осаждением насыщенным раствором сульфата аммония (1ч при 4°С). После центрифугирования (30 мин, 2000д, 0°С) осадок диализуют против буфера 0,025 М Na-фос- фат, рН 7,5, 0,15 М NaCi, 0,05% №N3 в течение 2 сут, затем проводят гельфильтра- цию на колонке с сефакрилом S-300 (объем колонки 500 мл), буферэлюцииО,0125М Na- фосфат, рН 8,4, 0.15М NaCI, 0,050% №N3. Выход пика иммуноглобулина контролируют по оптической плотности, степень очистки определяют по электрофорезу в полиакриламидном геле.
Очищенные монАТ штамма 4D4 сорби- руют на полистирольных пробирках из раствора с концентрацией 0,2 мг/мл в 0,01М трис-HCI, рН 7,5.0,1М NaCI. В качестве проявляющих антител используют монАТ штамма 8D6, предварительно меченых Ей следующим образом. 2,5 мг очищенных мо- нАТ штамма 8D6 растворяют в 0,5 мл 0,1М Na-фосфатного буфера, рН 9,0, и добавляют изотиоцианатофенилкомплексонат европия (150-кратный моляоный избыток), инкубируют 12-18 ч при 4°С.Эг несвязавшегося реагента освобождаются гель-фильтрацией на колонке с ультрагелем АсА34, размеры колонки: 1x27 см, буфер элюции 0.05М трис- HCI, 0.15М NaCi, 0,050 Na№, рН 7.5 (TBS). В пробирки с иммобилизованными монАТ штамма 4D4 вносят п 1 мкг меченых Еи монАТ штамма 8D6 в 350 мкл TBS, содержащего 0,02% твик-20 и 10% бычьей сыворотки. Затем с интерзалом 15с вносят по 50мкл разведений сывороток или соотьетструю- щих стандартов Мч. После инкубирования о течение 15 мин при комнатной температуре жидкую фазу отсасывают при помощи водоструйного насоса и добавляют в каждую пробирку по 400 мкл TBS, содержащее 0,20 твин-20 для отмывки. Процедуоу отмывки повторяют 3 раза, и отмытые пробирки добавляют по 400 мкл усиливающею раствора, выдерживают по 10 мин на встряхивателе и измеряют интенсивность флуоресценции на время разрешенном флуориметре.
Резльтаты опыта показывают, что даже при значительном разведении контрольной сыворотки {в 256 раз) получают достоверный сигнал, а метод двухсзйтной время- разрешенной флуороиммунометрии позволяет определять уровень Мч в диапазоне концентраций от 2 до 1000 нг/мл. Ана- логичный метод с использованием радионуклида ™ь характеризуется меньшей чувствительностью-минимальная концентрация Мч в пробе 10-15 нг/мл. Кроме высокой чувствительности следует отметить быстроту метода 30 мин (в случае РИА около часа), что крайне важно для экспресс-диагностики инфаркта миокарда.
Формула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L ВСКК (П) № 222Д - продуцент моноклональных антител к миоглобину человека.
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для количественного определения миоглобина в сыворотке крови человека. Целью изобретения является получение штаммов гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к неперекрещивающимся Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской практике для количественного определения миологлобина человека в сыворотке крови. Целью изобретения является получение нового штамма гибридных культивируемых клеток, продуцирующих моноклональные антитела (моиAT) к неперекрещивающимся эпитопам миоглобина человека. Штамм 4D4 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института эпитопам миоглобина человека. Штаммы получают гибридизацией иммунных клеток селезенки мышей BALB/c с клетками мие- ломы Х63-Ад8.653. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 222Д. Клетки штаммов культивируют на среде 1 М с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. МонАТ, продуцируемые штаммом 4D4. относятся к классу JgGI, имеют константу связывания с антигеном 2,85х109М 1 и направлены против неперекрывающихся эпитопов молекулы миоглобина. Культуральные свойства штамма типичны для гибридом, продуктивность в титрах антител в культуральной жидкости и в асцитической. МонАТ не теряют способность к связыванию с миоглобином после .модификациии их хелатными соединениями редкоземельных металлов, что дает возможность использовать их в двухсайтных флуороиммунометрических системах анализа. Чувствительность такого анализа составляет 2 нг миоглобина на 1 мл раствора. цитологии АН СССР под номером ВСКК (П) № 222Д. Штамм получают следующим образом. Мышей линии BALB/c иммунизируют раствором очищенного миоглобина человека. Первые инъекции миоглобина человека (Мч) проводят в сочетании полным и неполным адьювантом Фрейнда, заканчивают иммунизацию инъекциями Мч в физиологическом растворе. Слияние иммунных спле- ноцитов с клетками плазмоцитомы P3.X63-Ag8.653 проводят в присутствии 40% полиэтилен гликоля (Мол.м. 1000). Для отбора гибридных клеток в ростовую среду 4V N Ё О 00 ГО Ч) о
| J.lmmunol | |||
| Meth., 1981, 45, № 3, p | |||
| Трансляция, предназначенная для телефонирования быстропеременными токами | 1921 |
|
SU249A1 |
