Способ фракционирования нуклеиновых кислот Советский патент 1991 года по МПК C07H21/02 C12N15/00 C12P19/34 

сл

с

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, широко применяющихся в здравоохранении и сельском хозяйстве. Цель изобретения - снижение себестоимости конечных продуктов. Для этого способа предусматривает последовательное осаждение уксуснокислым калием суммарных однонитчатых РНК 1,4- 2,2 М и двуспиральных РНК 2,5-3,0 М, а осаждение ТРНК и ДНК осуществляется этиловым спиртом. Предложенный способ на порядок снижает себестоимость конечных продуктов f способствует улучшению экологической обстановки и условий труда, так как исключает использование токсичных веществ.

Изобретение относится к биохимии и биотехнологии, в частности к способам получения препаратов нуклеиновых кислот, широко применяющихся з здравоохранении и сельском хозяйстве.

В настоящее время известен ряд методов фракционирования смРНК, дсРНК и ДНК. Однако большинство из них для применения в крупномасштабном производстве непригодны, так как обладают принципиальными недостатками: сложностью исполнения и использованием дорогостоящих (как правило импортных) реактивов.

Известен способ фракционирования нуклеиновых кислот, включающий следующие последовательные стад ии: препарат нуклеиновых кислот наносят на колонку с целлюлозой ЦФ-11 (фирмы Ватман, Англия), колонку промывают 35%-ным этанолом, при этом элюируются ненуклеотидные примеси; колонку промывают 15%-ным этанолом, при этом элюируются рибосомаль- ные и транспортные РНК; колонку прсмывают е отсутствие этанола, при этом злюируютоя дсРНК.

Недостатком известного способа является нетех ологичность; использование дефицитного сорбента (целлюлоза ЦФ-11) и сложного оборудования (насос, проточный сектофотометр и т.д.), низкая производительность (нагрузка нуклеиновых кислот составляет 0,05 мг/г сорбента) и плохая эффективность разделения.

Наиболее близким к предлагаемому является способ фракционирования нуклеиновых кислот, заключающийся в том, что к раствору, нуклеиновых кислот добавляют хлористый литий до концентрации 2,0 М и выдерживают при 2-4°С; сформировавшийо

ю

Ю

ю со о

ся осадск, содержащий смРНК (в основном рибосомальные и матричные), отделяют цетрифугированием в течение 15-20 мин при 10000 об/мин и температуре 2-4°С. В дальнейшем центрифугирование проводят в этих же УСЛОВИЯХ. К надосадочной жидкости, содержащей дсРНК, тРНК и ДНК, до- оавляют хлористый литий до концентрации 4,0 М и выдерживают при 2-4°С. Осадок, содержащий дсРНК, собирают центрифугированием. ДНК и тРНК, содержащиеся в надосадочной жидкости, осаждают, добавляя 1-2 объема этанола. Осадок собирают центрифугированием.

В случае необходимости дополнительную очистку нуклеиновых кислот произво- дяг повторным фракционированием хлористым литием или другими известными способами.

Недостатком известного способа является высокая стоимость хлористого лития, что увеличивает себестоимость препаратов нуклеиновых кислот. Кроме того, хлористый литий относится к токсичным соединениям. Исходя из этого использование хлористого лития для промышленного получения нуклеиновых кислот ухудшает условия труда и экологически опасно.

Целью изобретения является снижение себестоимости препаратов.

Способ заключается в следующем. К раствору нуклеиновых кислот добавляют уксуснокислый калий до концентрации 1,4-2,2 NT и выдерживают при 2-4°С. Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием. К надосадочной жидкости, содержащей дсРНК, ДНК и тРНК, добавляют уксуснокислый калий до полной концентрации 2,5-3,0 М и выдерживают при . Осадок, содержащий дсРНК, собирают цэн- трифугированием, ДНКитРНК, содержащиеся в надосадочнй жидкости, осаждают, добавляя 1- 2 объема этанола. Осадок собирают центрифугированием.

По предлагаемому способу используют для фракционирования нуклеиновых кислот вместо хлористого лития уксуснокислый калий, что в 12 раз позволяет снизить себестоимость получаемых препаратов и отказаться от использования хлористого лития, при одновременном сохранении высокой эффективности фракционирования нуклеиновых кислот.

П р и м е р 1. К препарату суммарных кислот из киллерных дрожжей Saccharomyces cerevlsiae, штамма ВКПМ У- 448 (киллерной системы К2), растворенному в 30 ил дистилированной воды, добавляют 10 мл 8,0 М уксуснокислого калия (до конечной концентрации 2,0 М) и выдерживают 8-12 ч при 2-4°С.

Осадок, содержащий смРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл

0,05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Из надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа. К надосадочной жидкости добавляют 5,71 мл 8,0 М уксуснокислого калия (до

0 конечной концентрации 2,7 5 М) и выдерживают 8-12 ч при 2-4°С. Осадок, содержащий дсРНК собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). К надосадоч5 ной жидкости добавляют 90 мл этилового спирта и выдерживают в течение 8-12 ч при 2-4°С. Осадок, содержащий ДНК и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буфер0 ного раствора (при 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислот отбирают аликвоты по 20 мкл и анализируют их состав электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.

Для сравнения эффективности фракци5 онирования к 30 мл исходного раствора суммарных нуклеиновых кислот добавляют 10 мл 8,0 М хлористого лития (до концентрации 2,0 М) и выдерживают в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Из

0 надосадочной жидкости отбирают аликвоту для электрофоретического анализа. К надосадочной жидкости добавляют 20 мл 8,0 М хлористого лития (до концентрации 4,0 М) и выдерживают -в течение 8-12 ч при 2-4°С.

5 Осадок, содержащий дсРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 15 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). К надосадочной жидкости добавляют 120 мл этилового спирта и выдерживают

0 в течение 8-12 ч при 2-4°С. Осадок, содержащий ДНК-и тРНК, собирают центрифугированием и растворяют в 30 мл 0,05 М калий фосфатного буферного раствора (рН 7,0). Из всех растворов нуклеиновых кислототбира5 ют аликвоты по 20 мл и анализируют их состав электрофорезом в 1 %-ном -чгароз- ном геле.

Из представленных результатов следует, что эффективность фракционирования

0 смРНК, смРНК и ДНК с тРНК по предлагаемому и известному способам практически идентичны. При этом стоимость расходуемого на фракционировании реактива по предлагаемому способу в 12 ниже, чем по

5 известному.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить значительный экономический эффект, улучшить условия труда и экологическую обстановку на предприятиях, производящих препараты нуклеиновых

кислот, а его применение способствует по-осаждение смРНК и дсРНК возрастающими

вышению эффективности производства,концентрациями соли щелочного металла,

обеспечивающего здравоохранение и сель-отличающийся тем, что, с целью

ское хозяйство высокоэффективными сред-снижения себестоимости препаратов нуклествами противовирусной защиты и5 иновых кислот, в качестве соли щелочного

стимулятора резистентности организмов,металла используют уксуснокислый калий,

Формула изобретенияпричем смРН К осаждают при концентрации

Способ фракционирования нуклеино-соли 1,4-2,2 М, а дсРНК - 2,5-3,0 М. вых кислот, включающий последовательное