Способ получения цитохрома Р-450 Советский патент 1991 года по МПК C12N1/38 

(Л

С

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов. Целью изобретения является ускорение способа за счет сокращения времени индукции фермента. Способ заключается в том. что используется 18-часовая культура клеток Acholeplasma laldlawii, штамм ИЭМ-1, а в качестве индуктора - толуол в концентрации 0,01 об.%. Через 3 ч роста культуры в присутствии толуола клетки используют для получения индуцированного цитохрома. Выход составляет 1,5 ммоль/мг белка или 40-45 ммоль/r сырых клеток 2 табл

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам получения ферментов из культуры микроорганизмов.

Известен способ получения дрожжевого цитохрома Р-450 1.

Недостатком способа является то, что свойства фермента, получаемого согласно этому способу, могут определяться липид- ным окружением.

Наиболее близким в предлагаемому является способ получения растворимого цитохрома Р-450 из Bacillus megatherium 2,

Целью изобретения является ускорение способа за счет сокращения времени индукции фермента.

Способ заключается в том, что используется 18-часовая культура клеток Acholeplasma laidlawii, штамм ИЭМ-1, а в качестве индуктора - толуол в концентрации 0,01 об.%. Через 3 ч роста культуры в

присутствии толуола клетки используют для получения и характеристики индуцированного цитохрома.

Штамм ИЭМ-1 клеток Acholeplasma laldlawii депонирован в лаборатории микроплазм и L-форм бактерий НИИЭМ им Н Ф. Гамалеи.

Пример. Культивирование клеток проводят на среде, 1 л которой содержит, г: триптоза 20; ацетат натрия 5; хлористый натрий 5; хлористый калий 1,3; трис 3,4, рН 8,0-8,2. Перед посевом клеток в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота до концентрации 5 об %. глюкозу до 1 об.% и пенициллин 500 ед./мл. Культивирование клеток проводят при 37°С в течение 18 ч. После этого в культуру вносят толуол до конечной концентрации 0,01 об.% и выращивают еще 3 ч при постоянном встряхивании в колбе с притертой крышкой Затем клетки

Ov

Ю

со о

со

осаждают центрифугированием на центрифуге при 10000 g в течение 10 мин и дважды отмывает в том же режиме средой, содержащей 200 мМ хлористого натрия, 2 мМ ЭДТА, 50 мМ трис-HCI, рН 7,4. Осадок клеток суспендируют в 0,132 М К-фосфатном буфере или 100 мМ трис-HCI буфере, рН 7,4, и замораживают при - 20°С. Клетки и цито- зольную фракцию используют для определения активности полученного цитохрома в течение 3-5 дней.

Получение цитозольной фракции проводят следующим образом.

Клетки лизируют при комнатной температуре в бидистиллированной воде с добав- лением амидопирина до конечной концентрации 2 мМ (защита цитохрома от инактивации) в течение 30 мин. Далее осаждают неразрушеные клетки при 12000 g в течение 20 мин, а полученный супернатант центрифугируют при 105000 g в течение 1,5 ч для осаждения мембран. Полученный супернатант концентрируют при +4°С в течение 3-5 ч, используя фильтр. Цитозольная фракция имеет конечную концентрацию белка 2-5 мг/мл. Концентрацию белка определяют микробиуретавым методом.

Содержание цитохрома Р-450 в полученном препарате определяют по методу Омура и Сато, используя коэффициент молярной экстинкции для Р-450, равный 91 см 1, а для Р-420-1 . Содержание цитохрома Р-450 в контрольных (не индуцированных) клетках составляет 0,05-0,08 нмоль/мг белка, а в индуцированных - 1,2-1,5 нмоль/мг белка. Абсолютный спектр восстановленного ди- Тионитом и окисленного цитохрома записывают в диапазоне длин волн от 650 до 400 им на спектрофотометре М-40. Дифференциальный спектр цитохрома клеток Acholeplasma laldlawil, штамм ИЭМ-1 при индукции его толуолом совпадает со спектральными характеристиками фермента из Pseudomonas putlda.

Выход цитохрома Р-450 40-45 нмоль/мл сырых клеток.

Характеристические максимумы цитохрома Р-450 при его индукции толуолом в клетках Acholeplasma laidlawii, штамм ИЭМ- 1: окисленный 580, 530, 418 нм; восстановленный 550, 408 нм, Для клеток Ps. putida: окисленный 570, 535,418 нм; восстановленный 540, 408 нм.

Субстратную специфичность полученного, фермента проверяют следующим образом. 1 мл инкубационной смеси при определении скорости деметилирования амидопирина содержит 100 мМ К-фосфатно- го буфера, рН 7,6, 8 мМ амидопирина и 2-4

мг цитозольного белка. Реакцию запускают добавлением 6 мМ НАДФН.

Смесь инкубируют при постоянном встряхивании при 27°С в течение 30 мин.

После инкубации реакцию останавливают добавлением 0,4 мл 15% ТХУ. Пробы центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин. Для определения формальдегида отбирают 1 мл надосадочной жидкости и приливают 2

0 мл реактива Наше (0,26 мл ацетилацетона, 0,29 мл ледяной уксусной кислоты и 15,4 уксуснокислого аммония на 100 мл реактива). Пробы инкубируют 45 мин в водяной бане при 37°С и измеряют оптическую плот5 ность при длине волны 412 нм.

Скорость деметилирования кодеина и диметиланилина определяют также по концентрации образующегося в ходе реакции формальдегида. При этом инкубационная

0 смесь содержит 6 мМ кодеина или 6 мМ диметиланилина. Для построения калибровочных кривых используют стандартный 40%-ный формальдегид.

Гидроксилазная активность цитозоль5 ной фракции составляет по амидопирину 1,6 нмоль/мл белка, по кодеину - 2,4 нмоль/мл белка, по диметиланилину - 3,5 нмоль/мг белка.

Таким образом, при индукции цитохро0 ма Р-450 в клетках Acholeplasma laldlawil. штамм ИЭМ-1 наблюдается увеличение его содержания в расчете на 1 мг белка приблизительно в 30 раз.

При времени индукции, меньшем или

5 большем чем 3 ч, внутриклеточное содержание фермента меньше максимального. Меньший эффект наблюдается и при использовании меньшей концентрации толуола или более молодой культуры. Большую

0 концентрацию индуктора использовать нецелесообразно, так как концентрация 0,01 об.% близка к насыщающей.

Данные, показывающие зависимость содержания цитохрома Р-450 в клетках А.

5 laldlawil, штамм ИЭМ-1 при использовании 18-часовой культуры и толуола в концентрации 0,01 об.% от времени индукции средние значения из 3 опытов) приведены в табл. 1. Данные, показывающие зависимость

0 содержания цитохрома Р-450 в клетках А. laidlawii, штамм ИЭМ-1 от концентрации толуола и возраста культуры (средние значения из 3 опытов) приведены в табл. 2. Формула изобретения

5 Способ получения цитохрома Р-450, включающий введение химических соединений-индукторов в среду роста культуры микроорганизмов.отличающийся тем, что, с целью ускорения способа за счет сокращения времени индукции фермента, в

качестве микроорганизма используют культуру клетки Acholeplasma laidlawll, штамм ИЭМ-1, а в качестве химического соединения-индуктора - толуол в концентрации 0,01 об.%, который вводят вереду роста 18-часовой культуры и доращивают ее 3 ч.

Таблица 1

Таблица 2