Способ получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД) Советский патент 1991 года по МПК C12P19/36 C12P19/36 C12R1/13 

Ё

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения никотинамидадениндинуклеотида (НАД). Цель изобретения - повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса Культуру Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872 выращивают на первой стадии на питательной среде при дробном внесении источников азота и фосфора Поверхно- стно-активное вещество вносят в количестве, составляющем 5-7% от количества биомассы. На стадии биосинтеза после введения в среду предшественников НАД культивирование осуществляют при рН 6,5- 7,0 до достижения максимального количества в среде целевого продукта. Выход НАД 5,7-6,5 мг/мл. Продолжительность процесса 60-72 ч

Изобретение относится к биотехнологии, к области получения биологически активных веществ с помощью микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение выхода НАД и сокращение продолжительности процесса.

Процесс получения НАД методом глубинной ферментации можно рассматривать как двухстадийный. На первой стадии происходит накопление биомассы, а на второй, которая начинается после внесения в среду ПАВ и предшественников, размножение культуры прекращается и происходит синтез НАД. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium ammoniagenes АТСС 6872, которую выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, магния, кальция, стимуляторы

роста При этом источники углерода и азота вносят дробно по мере их исчерпания в питательной среде. Культивирование ведут до накопления биомассы не менее 12 мг/мл (по сухому весу), после чего вносят ПАВ и предшественники биосинтеза НАД. ПАВ вносят в количестве, составляющем 5-7% от количества биомассы. Было установлено, что выход НАД в сильной степени зависит от соотношения ПАВ и биомассы Отклонение от указанного интервала приводит к резкому снижению выхода НАД Дальнейшее культивирование ведут для биосинтеза НАД, поддерживая рН в среде в пределах 6,5-7,0, в течение 36-42 ч до достижения максимального количества НАД в среде Вне указанного интервала рН выход НАД значительно ниже. Культивирование в предлагаемых условиях позволяет стабильно

О

ю

00

о ел

VJ

получать высокий выход НАД (5,7-6,5 мг/мл).

П р и м е р 1. Культуру Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 выращивают при 8-32°С в аэробных условиях на питательной среде следующего состава, % глюкоза 10; КН2Р04 1; КаНРОд 1; MgS04 7Н20 1; aCl2 0,01; дрожжевой экстракт 1; мочевина 0,6; биотин 3 мкг %. Глюкозу, мочевину и биотин в виде водных растворов стерилизуют по отдельности и вносят в среду перед посевом. Для посева используют 10% жидкого инокулята, полученного при выращивании культуры на среде, содержащей, %: глюкоза 2; пептон 1; дрожжевой экстракт 1; NaCI 0,3; биотин 3 мкг%. Через 24 ч роста вносят в культуральную жидкость цетилпи- ридинийхлорид(ЦПХ) в количестве 1 мг/мл, никотинамид и аденин по 2 мг/мл. Культивирование продолжают еще 72 ч для дости- жения максимального выхода НАД, составляющего 2 мг/мл,

П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но перед посевом вносят все количество биотина (3 мкг%) и половину заданного количества глюкозы и мочевины (5 и 0,3% соответственно). При выращивании продуцента по мере исчерпания глюкозы в питательной среде добавляют остальное количество глюкозы и мочевины в два приема (через 12 и 20 ч от начала культивирования). После 24 ч роста биомасса достигла 15 мг/мл (по сухому весу). В это время вносят ЦПХ в количестве 0,75 мг/мл, что соответствует 5,0% от количества биомассы, затем добавляют аденин и никотинамид по 2 мг/мл каждого. Культивирование продолжают в течение еще 36 ч, поддерживая рН в среде в интервале 6,5- 7,0 с помощью 10%-ного NaOH или 10%-но- го . Выход НАД достигает 5,7 мг/мл.

Примерз. Способ осуществляют согласно примеру 1, но ЦПХ и предшественники вносят после 30 ч роста продуцента.

Концентрация биомассы составляет к этому времени 18 мг/мл, поэтому ЦПХ вносят в количестве 1,26 мг/мл, что соответствует 7,0% от количества биомассы. Культивирование продолжают в течение еще 40 ч и при этом выход НАД достигает 6,5 мг/мл.

П р и м е р 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но исходное содержание глюкозы в питательной среде составляет7%, а мочевины -0,45%. Через 30 ч роста в среду вносят оставшееся количество глюкозы и мочевины (3 и 0,15% соответственно), никотиновую кислоту и аденозин по 2 мг/мл и цетилтриметиламмонийбромид

(ЦТАБ) в количестве 0,9 мг/мл, Это количество ЦТАБ выбрано, исходя из того, что в момент его внесения концентрация биомассы в среде была 17 мг/мл. Культивирование продолжают еще 42 ч и получают НАД 6,2

мг/мл.

Таким образом, способ позволяет увеличить выход НАД на 185-225% и сократить время процесса с 96 до 60-72 ч.

Формула изобретения

Способ получения никотинамидаденин- динуклеотида (НАД, предусматривающий стадию культивирования продуцента Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872 на питательной среде, содержащей источники

углерода, азота, фосфора, магния, кальция, и стадию биосинтеза НАД в присутствии поверхностно-активного вещества и предшественников НАД, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода НАД и

сокращения продолжительности процесса, источники углерода и азота на стадии культивирования вносят дробно по мере исчерпания их в питательной среде и культивирование ведут до накопления биомассы

в количестве 12-18 мг/мл среды, а биосинтез НАД осуществляют при рН 6,5-7,0 и содержании поверхностно-активного вещества в среде 5-7% от количества накопленной биомассы.