Штамм @ @ @ -5-продуцент @ -лизина Советский патент 1984 года по МПК C12P13/08 C12R1/13 

(О

с:

Штамм Brevibacterium flavum V-5 (Коллекция Центрального музея промьшленных микроорганизмов института ВНИИГенетика, коллекционный номер ЦМПМ В-2798)-продуцент Ц-лизина.

1C

42

со l;i 11 Изобретение относится к микробиол гической промышленности и касается п лучения нового штамма, используемого для производства L-лизина. В период высокой скорости биосинтеза лизина самьй высокий выход лизина у тех штаммов, у которых наблюдается увеличение вклада пути прям го карбоксилирования фосфоенолпирувата (ФЕП)фосфоенолгшруваткарбоксилазой (ФЕП-к). Это обуславливает как высокий выход лизина, так и .высокую скорость биосинтеза лизина, ... Известен штамм . Brevibacterium SE 22П-Д-щ)одуцентЬ-лизина f 1/; ,ск6рост& биосинтеза лизина составляет 0,65 0,76 г/л.ч. Известен также штамм Brevibacteri flavum RC-115-продуцент Ц-лизина С2 Недостатком известного штамма явл ется невысокая скорость биоситеза лизина (1,09 - 1,11 г/лч) . Цель изобретения - получение штамма - продуцента лизина, обладаю-щего высокой скоростью биосинтеза лизина. Удсазанная цель достигается новым штаммом Brevibacterium flavum V-5, отобранным в качестве спонтонного мутанта при выращивании штамма Brevibacterium flavum RS-115 методом твердофазной ферментации на пшеничны отрубях с- мелассой. Родословная штамма Brevibacteritnn 22Л-С-132-РЕ-193-К8-115-У-5. Полученньй штамм имеет следующие морфологические и физиологические характеристики. Морфологические признаки. Микроморфология: клетки короткие палочки размером 1,0-2,7 мкм, бесспо ровые, неподвижные, грамположительные. . Макроморфология: на МПА 48-часова культура образует круглые колонии с гладкой поверхностью желтого цвета, диаметр колоний 2,2-3,6 мм. Физиологические признаки. Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, галактозу, миннозу рибозу, сорбозу, рамнозу, уксусную кислоту, фумаровую кислоту, яблочную кислоту, янтарную кислоту, пировиноградную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, метиловый спирт, этиловый спирт, глицерин, маннит, сорбит,слабо - рафинозу ксилозу. 4 Отношение к щеточникам азота: усваивает; (NH4)S 0, ()У.РО. , мочевину, . В среде с пептоном выделяет аммиак. Используют аспарагиновую кислоту, тирозин, изолейцин, серин, глутаминовую кислоту, фениламин, пролин, треонин, аргинин, гистидин, метионин, валин. Выделяет в среду рибофлавин и фолиевую кислоту. Обладает каталазной и уреазной активностью. Крахмал не гидролизует. Желатину не разжижает. Штамм Brevibacterium flavum. V-5 является гомосериновым ауксоотрофом. Для обеспечения роста культуры и биосинтеза лизина требуется гомосерин (или треонин + метионин), биотин и тиамин. Штамм Brevibacterium flavum V-5 отобран по признаку высокой скорости биосинтеза лизина и характеризуется высокой активностью начальных ферментов катаболизма глюкозы, особенно ФЕП-к и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г-6-Ф-ДГ). Активность ФЕП-к, Г-6-Ф-ДГ и фосфофруктокиназы (ФФК) у штаммов Brevibacterium 22ЛД, RC-115 V-5 при культивировании на кукурузно-мелассных средах с исходным значением РВ 10% представлена в табл. 1 Высокая активность ФЕП-к у штамма Brevibacterium flavum V-5 обеспечивает синтез оксалоацетата (предшественника синтеза лизина) с высокой скоростью. Кроме того, этот путь образования оксалоацетата (ОА) является экономически наиболее выгодньм по сравнению с другими альтернативными путями синтеза ОА. Повьш1енная активность Г-6-Ф-ДГ также способствует увеличению скорости синтеза лизина и скорости роста у штамма Brevidacterium flavurt V-5 no сравнению с другими штаммами. Количество синтезированного лизина, вь1ход лизина (Vp) и средняя скорость биосинтеза лизина при культивировании штаммов Brevibacterium tiavum V-Ь, 22ДЦ, и RC-115 периодическим способом на кукурузно-мелассной среде представлены в табл. 2. Благодаря указанным особенностям активности ферментов катаболизма углеводородов штамм Brevibacterium fiavum V-5 совмещает свойство увеличенной скорости синтеза лизина и скорости роста. Эти свойства сохраняются в широком диапазоне концентра ции РВ в среде (0,8-15%). Штамм особенно эффективен при культивировании непрерывным способом. Пример 1. Посевной материал Brevibacterium flavum V-5 готовят на среде следующего состава, %; меласса 5; кукурузный экстракт 1,5; сульфат аммония 0,5; рН среды 7,00,5. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин. Засевают 18-часовую культуру выращенную на МПА. Продолжительность 18 ч. Инокулят выращивают в 750 мл колбах Эрленмейера на качалке при 240 об/мин. Объем среды в колбах 30 мл. Выращивают при рН 7,00,5. Продолжительность 18ч. Ферментацию проводят на лабораторной установке ФУ-6 с рабочим объе мом 2,0л. В ферментационную среду вносят 5% инокулята. Культивирование осуществляют путем глубинной ферментации периодическим способом. Состав ферментационной среды-следующий, %: меласса 12 (по РВ), кислотный гидролизат БВК-0,08 (по аминному азоту), (NH)2S04 1,,5; 0,015. Питательную среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Условия ферментации: температура , рН 7,4 р02-10+5,0% от насыщения. Продолжительность ферментации 24 ч. Количество сичтезирован24

24

24

663

860

314

433,3

570

122

453,8

460

63 ного лизина 34,5 г/л. Количество биомассы (по сухому весу) 20,9 г/л. Скорость биосинтеза (продуктивность процесса) 1,43 . Выход от использованного сахара (по РВ)0,30 г лизина НС1/г субстрата. Количество неиспользованных РВ 0,8%. Пример 2. Посевной материал и инокулят готовят аналогично примеру 1. Ферментацию проводят в среде следующего состава, %: меласса 7 (по РВ), кислотный гидролизат БВК0,08 (по аминному азоту); (N114)2 Sb 1,5; КН2Р040,015. Биосинтез лизина осуществляют в проточных условиях.-Используют ферментационный стенд ФУ-6. Рабочая емкость аппарата 2,5 л. Режим процесса следукяций: температура 31 С рН 7,4 p02-t0+5,0% от насьпцения. Скорость протока 0,14 ч. Выходящий из ферментера раствор культурапьной жидкости содержит L-лизинмонохлоргидрат 20,1 г/л. Остаточные РВ 8 г/л. Биомасса (по сухому весу) 19,8 г/л. Выход лизина от использованного сахара (по РВ) 0,32 г лизина НС1/Г субстрата. Скорость биосинтеза (продуктивность) 2,8 г/л .ч. Таким образом, новый штамм Brevibacterium flavum V-5 продуцирует Ц-лизин с высокой скоростью, продуктивность процесса в 1,5-2 раза выше, чем у известных штаммов. Т а б л и ц а 1

24

24 56

24 55

Т а б л и ц а 2

0,30

0,76

0,28 0,30 0,65

0,33

1,11 0,35 1.09