Изобретение относится к биотехно- логии и может быть использовано при создании тромболитических средств.
Целью изобретения является повышение стабильности полипептида.
Согласно изобретению предлагается способ получения стабилизированного человеческо-проурокиназо-подобного полипептида, имеющего аминокислотную формулу
(Met) - Ser1- X(V- . .где Met - необязательно присутствующий иетионин;
Ser - расположенный первым N-концевой серии; X - либо находящийся в положении
135 треонин или глутамин; Y - находящийся в положении 157
фенилаланин,
сплошная линия обозначает аминокислотную последовательность, идентичную соответствующим частям аминокислотной последовательности природной человеческой проурокиназЫо
Пример U Получение РНК. 20 г клеток почечной ткани, замороженных при -80°С, измельчают в сме5
сл
00
ND
и
сителе в жидком азоте и суспендируют в 80 мл 5 М раствора гуанидинизоциана- та (5М гуанидинизоцианата, 0,5% N- лауроилсаркозина-натрия, 25 мМ тартра- та натрия, 0,1 М меркаптоэтанола и 0,1% анифоума А). Суспензию гомогенизируют в тефлоновом гомогенизаторе и нуклеиновую кислоту выделяют с помощью центрифугирования в хлористом цезии.
РНК растворяют в 2%-ном растворе ацетата калия, добавляют два объема этанола, оставляют на ночь при (-20) С и центрифугируют.
Поли(А) РНК вьщеляют и очищают с помощью олиго CdT) целлюлозной хроматографии, 10 г клеток почечной тка- ни дают около 3 мг РНК в целом, из
которых на поли(А) РНК приходится
о-1°
/-J/5.
г П р и м е р 2. Построение кДНК- библиотеки.
Синтез кДНК проводят с использованием 40 мкг поли(А)+РНК, полученной в примере 1. Используя| 40 мкг олиго (Т)( в качестве затравки, проводят реакцию с 40 единицами обратной тран- скриптазы в течение 2 ч при 4 2° С для синтеза первой цепи и после удаления матричной РНК путем щелочной обработки синтез второй цепи проводят с использованием 100 единиц фрагмента Кленова полимеразы 1.
После обработки нуклеазой-1 цепь (d С) связывают с 3 -концом двуни- тевой кДНК с помощью концевой дезок- синуклеотидилтрансферазы и получают около 400 мг кДНК с (dC)-хвостом.
Этот материал клонируют в pBR 322 и получают кДНК-библиотеку, состоящую из 2x10 тетрациклин-резистентных и ампициллин-чувствительных трансфер- мантов.
П р и м е р 3. Получение синтети- ческих ДНК-олигомеров для использования в качестве зондов для классификации кДНК-библиотеки.
С использованием фосфотриэфирного метода синтезируют следующие 16 ДНК- олигомеров, состоящих из 14 нуклеоти- дов, которые комплементарны, и РНК, соответствующей аминокислотной последовательности человеческой урокиназы Asn 169, Gin, Pro , Trp, Phe173:
AACCAAGGTTGATT AACCAAGGTTGGTT AACCAGGGTTGATT AACCACGGTTGATT
Q
5 Q
.,
0
5
AACCACGGTTGGTT
AACCATGGTTGCTT
AACCATGGTTGGTT
AACCAAGGCTGATT
AACCAAGGCTGGTT
AACCAGGGCTGATT
AACCAGGGCTGGTT
AACCACGGCTGATT
AACCACGGCTGGTT
AACCATGGCTGATT
AACCATGGCTGGTT
AACCAGGGTTGGTT
Эти 16 ДНК-олигомеров именуют как зонд Iо
Для использования в качестве подтверждающих зондов тем же путем синтезированы следующие 8 ДНК-олигомеров, состоящих из 14 нуклеотидов, которые комплементарны, и РНК, соответствующей Met28 Try, Asn, Asp, Pro287:
5 GGATCATTATACAT 3 GGATCGTTATACAT GGATCGTTGTACAT GGATCATTGTACAT GGGTCATTATACAT GGGTCGTTATACAT GGGTCGTT.GT.ACAT GGGTCATTGTACAT
Эти 8 ДНК-олигомеров именуют как зонд II :.
С использованием Т4-полинуклеотиг докиназы, 200 кг каждого из зондов I I и II метят радиоактивностью на 5 - конце с помощью получения зондов гибридизации колоний.
П р и м е р 4 „ Классификация кДНК-« библиотеки.
1. Классификация.
Нитроцеллюлозный фильтр помещают на LB-агарную среду,содержащую 15 мкг/мл тетрациклина,, и среду инокулируют трансформантами, полученными в примере 2, чтобы обеспечить рост 2000 колоний трансформантов. По прошествии 8 ч инкубирования при 37°С колонии реплицируют на два нит- роцеллюлозных фильтра, которые далее инкубируют в течение 3 ч при 37°0с Исходный нитроцеллюлозный фильтр используют в качестве эталона, тогда как два вторых фильтра переносят на LB-агарную среду,, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл хлорамфени- кола,и подвергают инкубированию, при 37°С в течение ночи. Фильтры затем помещают на 3 мин на 0,5 К NaOH и 1,5 М NaCl для осуществления лизиса колоний и денатурации ДНК, и после
нейтрализации на 0,5 М рН и 1,5 К NaCl сушат на воздухе и затем в печи при 8П°с в течение 2 ч.
После промывки фильтров в 4-х SSC в течение 30 мин каждый раз при 60°С, предгибридизацию проводят в 4xSSC, ЮхДенхардт и 50 мкг/мл денатурированной ДИК E.coli в течение ча- са при 60°С, и после добавления 0,1 мК АТР и меченного зонда гибридизацию проводят в течение 16 ч при 37 С. После промывки фильтры сушат на воздухе и классифицируют в отношении трансформантов, гибридизирующихся с зондом I, что дает 21 клон Плазмиды этих клонов в дальнейшем именуются плазмидами pKYU1-pKYU21 . Полученные 21 клон обрабатывают описанным выше путем и получают клоны, гибридизирукг- щиеся с UK их зондом II.Плазмиды в этих клонах в дальнейшем именуются плаз- мидой pKYU2 .
2. Характеристики ДНК плазмиды PKYU21.
После переваривания ДНК плазмиды pKYD21 с различными рестрикционными эндонуклеазами и субклонирования их в М13 тар8, определение нуклеотидной последовательности проводят с помощью ;методики завершения дидезокси-цепи . Путем контрастирования этой последовательности с известной аминокислотной последовательностью урокиназы подтверждают, что хотя кДНК содержит полную кодирующую область низкомоле кулярной урокиназы, отсутствует фрагмент ДНК длиной около 100 п„о. на 5 -конце кодирующей области высокомолекулярной урокиназы.
П р и м е р 5 Построение кДНК-1 библиотеки (II) с помощью реакции продления затравки„
Основываясь на нуклеотидной последовательности, определенной в п. 2. примера 4 с помощью фосфотриэфирного метода получают ДНК-олигомер
5 CTGAAGAGCATCAGA з , состоящий из
15 нуклеотидов, которые комплементарны мРНК-последовательности, соответ- ствующей Ser, Asp-, Ala, Leu, Clu. . Используя 100 мкг поли (А) + РНК в качестве матрицы, синтезируют первую кДНК-цепь с использованием 100 единиц
00
обратной транскриптазы и 1 мкг 7tp- меченной затравки с последующим синтезом второй цепи 100 единицами фрагмента Кленова ДНК полимеразн I К .coli. Затем однонитевую ДНК расщепляют
„
г JQ J5 20
25
30 ,Q
45
,,.
.
176
35
55
S1 -нуклеазоп и цепь (dC)M добавляют
1ТI
на 3 -конце, используя концевую деч- оксинуклеотидилтрансферазу. После отпуска этой вставки dC-хвостом (кДНК) и вектора с dG-хвостом (pRR 322), трансформируют I , coli X с получением кДНК-библиотеки, состоя-
А.
щей из приблизительно 5хЮ трансфер- мантов.
П р и м е р 6. Классификация кДНК- библиотеки.
Полученнне в примере 5 трансформанты подвергают гибридизации по методике примера 4. В этом случае в качестве зонда используют фрагментPstI - Bgl 115 плазмиды pl(YU21 . Гибридизацию проводят при 60°С0 Клоны, гнбридизи- рующиеся с указанным зондом, выявляют с помощью ауторадиографии и получают 8 положительных клонов„ Плазмидм этих клонов впоследствии именуются плазмидами рРЕ1-рРЕ8. После переваривания этих плазмидных ДНК рестрикци- онным ферментом PstI подтверждают, что плазмида рРЕЗ содержит кДНК- вставку длиной приблизительно 420 п.о.
Фрагменты, полученные перевариванием ДНК плазмиды рРЕЗ рестриктазой P st I, субклонируют в М13рп8 . В результате подтверждено, что кДНК содержит не только достаточно длинную область кодирования со стороны 51 конца проурокиназного гена, но также и нетранслируемую область 5 -конца, длиной 66 п.о. перед кодоком АТС инициации трансляции ,
Пример 7 Построение проуро- киназного гена.
5 мкг ДНК плазмиды pKYU21, содержащей полную область кодирования низ- комол екул яр ной урокинаяы, дважды переваривают 10 единицами рестриктазы Bgl Ни Hind III и выделяют фрагмент длиной 5,7 т.п„о. Затем ДНК плазмиды pKY21 переваривают дважды 10 единицами Bgl II и Ncol, а затем выделяют фрагмент размером 66 . После этого 5 мкг ДНК плазмиды рРЕЗ, полученной в примере 6, переваривают лважды 10 единицами NcOI и Hind III с получением ЦИК-фрагмента 1,1 т.п.оа Эти три ДНК-фрагмента повторно экстрагируют фенолхлороформом, осалдают 2 2 объемами этанола, осадок выделяют и очищают. Эти три разных ДНК-фрагмента связывают между собой с помощью Т4ДНК-лигазы и трансформируют клетки E.coli X б. Трансформанты к ыгсифи
цируют по методике щелочного лизиса И получают клон, несущий плазмиду jpKYU22, которая содержит полный ген Проурокиназы,
Примерв. Определяют нуклео- тидную последовательность сайта плаз-4 миды pKYU22 .
Пример9о Синтез проурокиназ- tioro гена, модифицированного на 5;- }сонце.
Структуру 30 п.о о 5 -концевого участка кДНК, кодирующей проурокиназу (пример 7), изменяют так, чтобы обес- печить эффективную экспрессию проуро- киназного гена под контролем SD-последовательности гена С230 на основе Pseudomonas putjd e .
По фосфотриэфирной методике синте-; зируют следующие три одноцепочечных ДИК олигомера, включающих 29,15 и 20 нуклеотидов соответственно;
(KiAggMgj CTCCACCAGGTTCCGT з 3. TG CTCGIlGj: Ъ
fCGAGGTGGTCCAA(iGCAGC 5
1 мкг каждого из синтетических ДНК-олигомеров нагревают в течение 2 мин при 95 С, фосфорилируют на 5 - конце Т4-тюлинуклеотид-киназой, очи фют и высушивают. Очищенный материал растворяют в 50 мкл 20 мМ , рН 7,6 и 10 мМ M gCl ,прогревают в течение 2 мин при 95°С, медленно ох- л|аждают до комнатной температуры, а э атем задерживают в течение ночи при
12 С с получением следующей двуните- вой ДНК:
5 мкг ДНК плазмиды pKYU22 дважды переваривают рестриктазами Bgl III и Aat 1Г и вьщеляют ДНК-фрагмент раз- мером 5,7 т„п.о. Затем 5 мкг ДНК той же плазмиды дважды переваривают рестриктазами Pst 1и Bgl II и: получают ДНК-фрагмент размером 400 и.о. Этот фрагмент вновь переваривают рестриктазой Tag I и вьщеляют фрагмент размером 260 п.о. Эти два ДНК-фрагмента очищают экстракцией фенолхлороформом и осаждением 2 объемами этанола.
ДНК-фрагменты и указанный двуните- вой синтетический ДНК-олигомер связывают с помощью Т4 ДНК-лигазы и трансформируют в клетки E.coli Трансформанты классифицируют по методике щелочного лизиса .и получают клон E.coli X 1776/рКМШ, несущий плазмиду
О
5
Q
5
о
5
0
5
0
рКМШ, которая содержит модифицированный проурокиназный ген.
Пример Ю. Построение плазмиды pMUT4L .
5 нкг плаэмиды рКМШ из примера 9 переваривают 10 единицами эндонукле- азы Aat II и вьщеляют после обработки кишечной фосфатаэой телят. Затем 5 мкг плазмиды рТСМ1 переваривают 10 единицами эндонуклеазы Aat II, вьщеляют фрагмент размером 500 п.о. Фрагменты очищают повторной экстракцией фенол/ /хлороформом и осаждением этанолом.
Фрагменты лигируют и трансформируют в Eocoli JM103 Отбирают клон, несущий плазмиду pMU TIL, в которой t аспромотор-оператор и C230SI) - последовательность имеют правильную ориентацию относительно проурокиназ- ного гена.
Пла змида pTCKf содержит область управления экспрессией, включающую tac-промотор-оператор, последовательности lac SD, C230SD, а также структурный ген С230.
5 мкг плаэмиды рКК223-3 переваривают 10 единицами рестриктазы Hind III, обрабатывают кишечной фосфатазой телят.
Затем 1 мкг плазмиды pMU TIL переваривают 4 единицами эндонуклеазы Dral и оставшийся от переваривания фрагмент и 1 мкг 5 -фосфоршшрованно- го Hfnd III-линкера (d CAACGTTG) лигируют. Проводят переваривание с использованием 12 единиц эндонуклеазы Hind III и растворяют в 0,15 К NaCl, экстрагируют равным объемом фенол- хлороформа и ДНК осаждают добавлением 2 объемов этанола. Осадок собирают центрифугированием и высушивают.
Фрагмент переварива.ния pMUTIL и фрагмент Hind III-pKK223-3 лигируют и трансформируют в E.coli JK103C Отбирают клон E.coli JMlOS/pKU T2L, содержащий плазмиду pMUT2 . .
5 мкг плазмиды pKUT2L переваривают 10 единицами эндонулеаэ Sph и Tth III I и после экстракции фенол - хлоро- - формой ДНК осаждают этанолом ДНК затупляют с использованием Т4-полиме- разы и лигируют,, ДНК трансформируют в E.coli JMJ03 и клетки выращивают на LB-среде, содержащей 50 мкг/мл ампицилина, и отбирают клон E.coli JMI03/pMUT4L .
у1
ер 11. 1 . Получение одно
т-
Прим нитевой ДНКо
По 1 мкг плазмиды pKYU22иМ13рт 8-фаговой двунитевой ДНК перевариваю в 20 мкл раствора, содержащего Ю мК трис-HCl (рН 7,5), 7 мК tgClg, 7 мМ А-меркаптоэтанола и 50 мК Ка(Я в течение часа при 31°С, с использованием 5 единиц Pst I . фрагменты ДНК выделяют, лигируют и трансформируют клетки R.coli JM103. Трансформанты высевают на агар, со7 ержащий 0,02% X-gal и 1 мМ fPTC, культивируют в течение ночи при 37°С. Однонитевую ДНК получают из белых блямек, образованных рекомбинантом.
Однонитевую ДНК используют в каче стве шаблона, определяют последовательность оснований и подтверждают последовательность клонированной од; нонитевой ДНКо
2. .Синтез двунитевой ДНК.
Используя клонированную цепь одно- нитевой ДНК в качестве шаблона и син- тетической олигонуклеотид
5 GATGGACAAAAGCCC з
в качестве затравки (1), проводят реакцию полимеризации с помощью ДНК- полимеразы Кленова.
3 Переваривание с помощью SI- нуклеазы.
Переваривание с SI-нуклеазой проводят для устранения из результирующей двунитевой ДНК непрореагировавшей одноиитевой ДНК, служащей в качестве фона. 2 мкл реакционной смеси гидроли зуют SI-нуклеазой, инкубируют при 26°С в течение 30 мин. Реакцию завершают добавлением 10 мкл 0,25 М трис- HCl (рН 8,0).
4.Трансформация E.colj. JM103,
10 мкл указанной реакционной смеси трансформируют E.coli JMI03.
5.Классификация мутантов.
С использованием зонда - олигонук- еотида, использовавшегося в качестве затравки, фаговые бляшки классифицируют гибридизацией бляшек для определения мутантного фага. Бляшки переносят с мягкой агаровой среды на нитроцел- люлозный фильтр, нагревают в вакууме в течение 2 ч при 80°С и гибридизирую в течение ночи в растворе,, ильтр промывают и мутантно-фаговые бляшки, дающие положительные сигналы, изолируют. Мутантный фаг дает мутантно-фаго- вую ДНК двунитевого типа (pn I) .
10
10
15
20
25
-
.г
35
40
Пример 12. введение мутации в кодон 135-й аминокислоты с использованием фага К13 (2).
В качестве шаблона с использованием нового олигонуклеотидного мутагена проводят введение сайт-специфической мутации. К этом случае в качестве затравки (2) использован синтетический олигонуклеотид
S GGAACAAAGCCCTCCTCT з
Этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен урокиназному гену Б однонитевой шаблонной ДНК, изменено лишь одно основание, как это можно видеть по изменению кодона ААА лизина на кодон АСА треонина.
2 пмоль 5 -фосфорилированной затравки добавляют к 0,5 пмоль шаблонной однонитевой ДНК и инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ трис-HCl (рН 7,5) 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ NaCl и 7 мМ -MgCl 2 в течение 20 мин при ЬО С. Дальнейшее инкубирование проводят в течение 20 мин при 23°С, К реакционной смеси добавляют ,1АТР, d GTP, d TTP и dCTP до концентрации 0,5 мК и 2 единицы ДНК-полимеразы. Смесь инкубируют 20 мин при 23дС, а после добавления 1 мкл 10 мК АТР и 1 единицы Т4 ДИК- лигазы инкубируют в течение ночи при 12°С. Смесь трансформируют в E.coli JKI.03.
Бляшки переносят с агара на нитро- целлюлозный фильтр, прогревают при 80°С 2 ч, гибридизируют с затравочным олигонуклеотидом. Затем фильтр промывают и мутантные фаговые бляшки, дающие положительные сигналы, изолируют. Из мутантного фага получают двуните- вую ДНК (рт2), определяют нуклеотид- ную последовательность и подтверждают наличие требуемой мутации в виде замещения одного основания.
Пример 13. Построение плазмиг ды pMUP1, содержащий ген человеческой проурокиназы.
Используя плазмиду pYTUI, содержащую PL-промотор и SD-последовательность и С230 в качестве вектора, строят плазмиды, содержащие урокиназ- ную кДНК, полученную на основе человеческой почечной ткани. Для -этого 10 мкг плазмиды pYTU I переваривают 10 ед. Sal I и Aat II в 100 Мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-НГД (рН 7,4), 7 мМ MgGlgH 150 мК NaCl , в течение 2 ч при 37°С и выделяют
фрагмент ДНК Sal I - Aat II длиной около 4,5 т.п о о,
10 мкг плазмиды pKMU I переваривают 10 ед. Dra I в 100 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рИ 7,4), 7 мМ MgClg и 60 мМ NaCl в течение .2 ч при 37°С, добавляют АТР в концентрации 0,66 мК. После добавления 1 мкм Sal I - ликерной ДНК ..(S GGTCGACC 3) и 100 ед. Т 4 ДНК-ли- газы смесь инкубируют при 12°С в течение ночи. ДНК-фрагменты вьщеляют с помощью обработки фенолом и эта- нольного осаждения и переваривают 10 ед. Aat II и Sal I в 100 мкл вора, содержащего 10 мМ (рИ 7,4), 7 мМ MgGl2 и 150 мМ NaCl в течение 2 ч при 37°С и с помощью электрофореза в агарозном геле выде- ляют ДНК-фрагмент человеческой уроки - пазы длиной около 2,2 т.п.о. По 1 мкг каждого из фрагментов смешивают и ли гируют в течение ночи в 20 мкл раствора, содержащего 66 мК трис-НС1 (рН 7,4), 7 мМ MgOlfc, 0,66 мК ATP и 10 мМ дитиотреитола при 12°С с использованием 100 единиц Т4 ДИК-лига- зы. Лигазной смесью трансформируют E.coli HB101, отбирают клон, несущий плазмиду pMUPI«.
Пример 14. Построение плазмиды pMUPIpm .
Используя мутантную М13- фаговую двуиитевую ДНК, содержащую кДНК- фрагмент, в котором кодон ААА, определяющий лизин в положении 135 от ,К конца урокиназы, мутирован в кодон САА, определяющий глютамин, и плазми ду pMUPT, имеющую проурокиназный ген ниже PL-промотора и С23О SD-последова тельности, строят плазмиду, содержа- щую мутированный ген. Для этого 10 мкг мутантной М13 - двунитевой ДНК переваривают с помощью E-st I и вьщеляют фрагмент длиной около - 1,2 т.п.о,
10 мкг плазмиды pKUPI частично переваривают с помощью Pst I и выде ляют фрагмент длиной около 5,4 т.п.о, из которого удаляют лишь фрагмент длиной около 1,2 топ.о„ Фрагменты вьщеляют и лигируют. После трансформации получают клон, содержащий плазмиду pMUPIpm..
Плазмида pMUPlpm содержит область, кодирующую человеческо-проурокиназо- подобный полипептид в сайте ниже PL-промотора.и С230 SD-последователь-
..
.10
15
25
™
| ,
.
5
30
35
40
45
50
ности. В этой области кодирования кодоны, определяющие шесть N-концевых аминокислот указанного полипептида, заменены кодонами, которые экспрессы- руются в E.coli, и кроме того, кодон ААА, определяющий Lys в положении 135, заменен на кодон САА, определяю- щий глютамин.
Пример 15. Построение плазмиды pKUT4Lpra2 со структурным геном проурокиназы и точечной мутацией ниже tac-промотора.
10 мкг М13-мутантной двунитевой ДНК гидролизуют рестриктазой Pst I, вьщеляют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг pMUT4L .частично переваривают с помощью Pst I и вьщеляют фрагмент длиной около 4,6 т.п.о. Фрагменты смешивают, лигируют и трансформируют в E.coli НВЮ1„ ТрансФорман- ты классифицируют по методике щелоч- ,ного лизиса и получают клон, содержащий плазмиду рКиТ4 рт2 .
Пример 16..Введение мутации в кодон 157-и аминокислоты, - 1. Получение однонитевой шаблонной ДНК.
По 1 мкг плазмиды pKYU22 и фаговой М13тр8-двунитевой ДНК переваривают в 20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 7 мК KgCl, 7 мМ и -меркаптоэтанола и 50 мМ NaCl в течение 1 ч при 37°С с использованием 5 единиц Pst I.
Фрагменты вьщеляют, лигируют, k jтрансформируют в E.coli M103 транс- форманты высевают на мягкий агар, содержащий 0,02% X-gal и 1 мК ИПТГ. Пластинки инкубируют при 37°С в тече- ;,ние ночи. Однонитевую ДНК получают из белых бляшек, образованных реком- бинантом. i 2, Введение мутации
С использованием результирующей рекомбинантной М13-фаговой однонитевой ДНК в качестве матрицы введение мутаций проводят с помощью другого олигонуклеотидного мутагена. В этом случае в качестве затравки используют, синтетический олигонуклеотид
5Г GGCCCCCiCGATAA ATTA 3
Хотя этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен урокиназному Геку в однонитевой шаблонной ДНК, два основания изменены. Кодон ТТТ, определяющий фенилаланин, заменен на кодон GAT, определяющий аспарагиновую кислоту„
25
С использованием упомянутого оли- гонуклеотида в качестве затравки дву- нитевую ДНК синтезируют in vitro, Для этого 2 пмоль 5 -фосфорилирован- г ной затравки добавляют к 0,5 пмоль матричной однонитевой ДНК, инкубируют в 10 мкл раствора, содержащего 7 мМ трис-HCl (рН 7,5), 0,1 мК ЭДТК, 20 мМ NaCl и 7 мК MgCl4, в течение 20 мин |Q при 60°CJ с последующим инкубированием При 23°С в течение 20 мин, к реакционной смеси добавляют по 0,5 мКЛАТР, dGTP, dTTF и dCTP до объема 20 мкл и 2 единицы ДНК-полимеразного фраг- 15 мента Кленова. Смесь инкубируют при 23°С в течение 20 мин и после добавления 1 мкл 10 мМ АТР и 1 единицы Т4- ДНК-лигазы еще в течение ночи при 12°С0 Реакционную смесь трансформиру-20 ют в E.coli JK103 и получают около 100000 фаговык бляшек на микролитр указанной реакционной смеси.
После переноса бляшек с мягкого агара на нитроцеллюлозный фильтр фильтр нагревают в вакууме.при 80 С в течение 2ч, гибридизуют с затра- ;вочным олигонуклеотидом, меченым с помощью р, промывают в bxSSC при 52°С и бляшки мутантного фага, даю- щие положительные сигналы, выделяют ауторадиографически. Кз мутантного фага получают мутантно-фаговую ДНК двунитевого типа (рпЗ) .
Можно заменить кодон ТТТ, опреде- с ляющий фенилаланин в положении 157, Glu-определяющим кодоном GAA с использованием олигонуклеотида
5 GGCCCCGCGAAAAGATTA 3 в качестве мутагена.
Пример 17. Построение плаз- миды pMUT4Lpro3, в которой структурный ген урокиназы, имеющий точечную мута- цию, вставлен ниже E0coli tac-промо- тора.
10 мкг К13-мутантной двунитевой ДНК (рпЗ) с помощью Pst I выделяют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг плазмиды pKUTAL частично переваривают с помощью Pst I и выделяют фрагмент длиной около 4,6 т.п.о.
Фрагменты смешивают, лигируют и используют для трансформации E.coli НВ101. Получают клон, содержащий плазмиду pKUT4Lpm3 ,
Пример 18. Построение плазми- ды рКК trp..
5 мкг плазмиды рКК 223-3 гидроли- зуют 30 единицами ЕсоК I и 20 едини-
30
40
45
50
55
5
0
с
0
0
5
0
5
цами Pvu II в 100 мкл буфера (10 мМ , рИ 7,5, 10 мМ KgClj., 50 мМ NaCl и 1 мМ ДТТ) в течение 1 ч при 37°С. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7% агарозе и ляют ДНК-фрагмент длиной около 2600 п.о, содержащий ген ампицилин- резистентности, область инициирования репликации в область rrn ВТ Т2 окончания транскрипции.
Фрагмент обрабатывают ДНК-полимер-1 азой в 25 мл буфера (50 мМ трис-ИС1 (рН 7,2), 10 мМ KgSOf, 0,1 мК DTT и 80 мкМ dNTPS) в течение часа при 25°С и обозначают как (А).
10 мкг плазмиды PSTN16 и по 20 ед гидролизуют рестриктазами Cla I и Pvu II, вьделяют фрагмент длиной около 300 п.о., содержащий промотор, оператор и рибосомо-связывающий сайт триптофанового оперона.
Фрагмент обрабатывают ДНК полиме- разой и обозначают (В).
Далее по 0,5 мкг ДИК - фрагментов (А) и (В) лигируют и продукт реакции используют для трансформации E.coli НВ101. Ампицилин-резистентные трансформанты отбирают для выделения колоний, несущих плазмиду рКК trp, и требуемую плазмиду выделяют.
Пример 19. Построение плазми- ды ptrpUK2 .
1 мкг плазмиды рКК trp гидролизуют рестриктазок и выделяют требуемый ДНК-фрагмент (С).
10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой, выделяют фрагмент размером 640 п.о,, содержащий N-концевую область гена человеческой урокиназы. Этот фрагмент обозначен (D).
ДНК-фрагменты (С) и (Д) лигируют и используют для трансформации E.coli НВЮ1. Отбирают колонии, несущие плазмиду ptrpUKE, и выделяют требуемую плазмиду.
1 мкг плазмиды ptrpUK расщепляют рестриктазой PstI и выделяют требуемый фрагмент ДНК (Е).
10 мкг плазмиды pKUT4L расщепляют1 рестриктазой и выделяют фрагмент (F) длиной 1,2 т.п.о., содержащий С- концевую область гена человеческой урокиназы.
Фрагменты (Е) и (F) лигируют и используют для трансформации E.coli НВ101. Из ампицилин-резистентных трансформантов отбирают колонии, несущие плазмиду ptrpUKZ, и выделяют требуемую плазмиду.
П р и м е р 20. Построение плазми- Ды ptrpUK2 (1135).5
Двунитевой мутантный фаг M13RF (1135), в котором вставлен ДНК-хЬраг- Мент, кодон ААА которого, определяю- , рщй лизин в положении 135, мутационно заменен на кодон АТА, определяющий JQ |изолейцин, получают по методике при- ftepa 11, за исключением применения следующего синтетического олигонукле- Ьтида в качестве затравки:
5 CAGATGGAATAAAGCC З1
t5
1П мкг фаза M13RF (1135) полностью Ьереваривают с использованием PstI р выделяют ДНК-фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 1 мкг плазмиды ptrpUK2 Полностью переваривают с помощью PstI (выделяют ДНК-фрагмент длиной около 3,4 т.п.о и используют в качестве ректора. Фрагменты лигируют с использованием Т4-ДНК лигазы и реакционную смесь используют для трансформации E.coli НВ101о Классифицируют ампици- лин-резистентные колонии и получают клон, содержащий плаэмиду ptrpUK2 (1135) Все условия проведения этой Процедуры соответствуют описанным в примере 4.
Пример 21. Построение плазми- ды ptrpUK (E135).
Двунитевой мутантный фаг M13RF (Е135), в котором вставлен ДНК-фраг- мент, кодон ААА которого определяю щий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон GAA, определяющий глютаминовую кислоту, получают по методике примера 10, за исключением применения следующего синтетического нуклеотида в качестве затравки;
5 GATGGAGAAAAGCCT з
Затем по методике примера 20 из фага M13KF (135) и плазмиды StrpUK2 получают плазмиду ptrpJJK2 (K135).
Пример 22о Построение плазмиды ptrpUK2 (Q135 Д 157)„
Двунитевой мутантный фаг, в котором вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого изменен на кодон САА, определяющий глюамин, получают по методике примера 11, за исключением применения синтетического нуклеотида в качестве затравки:
5 GATGGACAAAAGCGC 3
Затем по методике примера 1t из указанного фага получают однонитевую фаговую ДНК и по описанной выше мето
Q
5
Q 5 0
дике получают двунитевой мутантный фаг M13RF (Q 135 Д 157), в который вставлен ДНК-фрагмент, кодон ААА которого, определяющий лизин в положении 135, мутационно изменен на кодон САА, определяющий глютамин, и кодон ТТТ, определяющий фенилаланин в положении 157, аналогично изменен на кодон GAT, определяющий аспарагиновую кислоту, за исключением использования синтетического олигонуклеотида 5 GGCCCCGCGATAAGATTA 3 в качестве затравки, в результате чего меняют кодон ТТТ, определяющий фенилаланин в положении 157 на кодон CAT, определяющий аспарагиновую кислоту.
Плазмиду trpUK2 (0135 Д 157) получают из M13RF (0135 Д 157) и плазмиды ptrpl)K2 по методике примера 20.
Пример 23. Построение плазмиды trpUK2 (E135 Д 157).
Двунитевой мутантный фаг M13KF (Е135 Д 157), в котором вставлен ДНК- фрагмент, кодон ААА которого, опреде- ляющий лизин в положении 135, мутаци- онно изменен на кодон GAA, определяющий глютаминовую кислоту, а кодон ТТТ, определяющий фенилаланин в положении 157, изменен на кодон GAT определяющий аспарагиновую кислоту, получают по методике примера 22 за исключением использования синтетического нуклео5
0
5
0
.1,
тида 5 САТССАСААААССССТ 3 для мутационного изменения кодона ААА, определяющего лизин в положении 135, на кодон GAA, определяющий глютамино- вую кислоту.
Далее по методике примера 20 плазмиду trpUK2 (E135 Д 157).получают из M13RF (Е135 Д 157) и trPUK2 .
Пример 24, Экспрессия проуро- киназо-подобного полипептида.
Плазмиды pMUPI и p ttUPIp, полученные соответственно в примерах 13 и 14, трансформируют обычным путем в E.coli W3110 и результирующие транс- форманты культивируют при 30°с в 50 мл L-бульона Температуру культу- ральногЪ -бульона повышают до 42°С, когда поглощение на 600 нм достигает 0,3, и дальнейшее инкубирование проводят в течение 3 ч при экспрессии урокиназного гена.
Пример 25. Экстракция генного Продукта из E.coli и его свойства.
Клетки E.coli 3110 собирают из 5 мл жидкой среды, описанной выше, и после суспендирования клеток в
i 7
0,5 мл раствора, содержащего 7,5 М гуанидин гидрохлорида и О,05 К трис- НС1 (рН 7,5), суспензию оставляют стоять на 90 мин при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугиру ют при 1(100 об/мин и после разбавления надосадочной жидкости в 5 мл раст (вора, содержащего 1М гуанидин гадро- хлорида, 0,05 трис-HCl, рН 7,5.
2 мМ глутатиона, смесь инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Затем диализируют 4 ч при 4°С относительно 100-кратного объема раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 7,4) и 0,4 К Nad, и дальнейший диализ проводят 2 ч относительно 100- кратного объема раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl (рН 754) и 0,1 М Nad.
К части результирующего сырого экстракта добавляют трипсин до конечной концентрации 30 мкг/мл и смесь инкубируют 1 ч при 37°С. В качестве контроля аналогично инкубируют смесь, содержащую воду вместо трипсина.
Указанные смеси подвергают электрофорезу в геле, содержащем 12,5% полиакриламида. Гель погружают в 2,5% тритон X-100 и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Затем гель наслаивают на фибрин-агаровую пластинку и инкубируют 1-2 ч при 37№Со После этого оценивают молекулярную массу по располржению растворенной зоны на фибрино-агаровой пластинке. Для сравнения проводят электрофорети- ческую миграцию стандартной пробы урокиназы, полученной на основе человеческой мочи.
Полученный на основе плазмиды pMUPI генный продукт имеет молекулярную массу около 50.000, часть продукта преобразована в низкомолекулярные фрагменты молекулярной массой около
JQ
Q 5
,0 58271а
Плазмиду pMUT4Lpn2, полученную в примере 25, трансформируют в E.coli ЛИ 03 и трансформант культивируют в 5 мл L-бульона при 37°С. Экспрессию индуцируют добавлением КГП.Т (изо- пропил- -и-тпогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5,v и дальнейшее культивирование ПРОВОДЯТ в течение 3 ч при 37°С для экспрессии урокиназного гена.
Сырой экстракт получают после обработки 5 мл указанной жидкой среды по методике примера 25 и часть сырого экстракта обрабатывают трипсином0
Эти препараты подвергают электрофорезу в геле, содержащем 10% полиакриламида, гель погружают в 2,5% тритон X-100, после чего инкубируют при комнатной температуре в течение часа. Гель наслаивают на фибрино- агаровую пластинку и инкубируют 2 ч при 37°С. Молекулярную массу оценивают по местоположению растворенной зоны ча фибриноагаровой пластинке. Для сравнения осуществляют также электрофоретическую миграцию стандартного образца урокиназы из челове- ческой мочи и обработанного трипсином препарата, полученного в примере 25.
Продукт плазмиды pMUT4Lpm2 с трудом преобразуется до низкомолекуляр- кого компонента, как это происходит в случае генопродукта на основе плаз- миды рМиИрш , Молекулярная масса этого продукта несколько ниже этого показателя для высоко- и низко-молекулярных урокиназ из человеческой мочи, например, 50„000 и 30.000 в сравнении с 54.000 и 33.000, что возможно связано с неприсоединением гликозидных цепей в клетках E.coli.
Пример 27 Экспрессия проуро-
30
35
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при создании тромболитических средств. Целью изобретения является повышение стабильности целевого продукта„ Согласно изобретению генно-инженерными методами конструируют рекомбинантные плазмидные ДИК pMUPIpm, pMUTULpm2, ptrpUK2, кодирующие синтез проуроки-, назы, трансформируют ими гатаммы бактерий Escherichia coli . После культивирования штаммов выделяют полипеп- тид, обладающий свойствами проуроки- назы, с аминокислотной последовательностью Met-Ser X35-Y1s7,ivi,e Ketu Ser - аминокислоты метионин и серии, Х-глибо глутамин, либо треонин, -«фенилаланин. 2 табл. сл с
50
ботки. Полученный на основе плазмиды pMUHpm генный продукт также имеет молекулярную массу около 50.000, но не преобразуется в низкомолекулярный материал в ходе трипсиновой обработки. Молекулярная масса этих продуктов несколько ниже, чем у высоко- и низкомолекулярных урокиназ, получен- . ньгх из человеческой мочи, 50.000 и 30.000 в сравнении с 54.000 и 33.000, что связано с неприсоединением гликозидных цепей в клетках E.coli..
Пример 26„ Экспрессия проуро- киназо-подобного полипептида.
Плазмиду pMUT4Lpm3, получе в примере 17, трансформируют JMI03, трансформант инкубирую 5 мл L-бульона при 37°С. Эксп индуцируют добавлением К1ПТ д ной концентрации 1 мМ, когда ние на 550 нм достигает 0,5, нейшее культивирование провот; при 37°С для экспрессии уроки гена.
Клетки E.coli JMI03 собира
После суспендирования клет оставляют стоять на 40 мин при натной температуре, затем цен
0
Плазмиду pMUT4Lpm3, полученную в примере 17, трансформируют в E.coli JMI03, трансформант инкубируют в 5 мл L-бульона при 37°С. Экспрессию индуцируют добавлением К1ПТ до конечной концентрации 1 мМ, когда поглощение на 550 нм достигает 0,5, и дальнейшее культивирование провот;ят 3 ч при 37°С для экспрессии урокиназного гена.
Клетки E.coli JMI03 собирают.
После суспендирования клеток их оставляют стоять на 40 мин при комнатной температуре, затем центрифуги-
pywr и после разбавления надосадоч ной жидкости инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Смесь ди ализируют, как описано выше.
Кутантную (РтЗ) урокиназу очищаютt подвергая результирующий сырой экстракт аффинной хроматографии с использованием сефарозной колонки, с кото рой связаны антиурокиназо-монокло- нальные антитела.
I П р и м е р 28. Экспрессия npoypoкиназо-подобного полипептида,
Плазмиды ptrpUK2 (0135Д157) и ptrpUK2 (Е135 Д 157), полученные в примерах 22 и 23, трансформируют в E.colirWSl10, трансформанты инкубируют, индуцируют добавлением IAA (индолуксусная кислота) до конечной концентрации 50 мкг/млэ когда погло- щение на 550 нм достигает 0,5, и дальнейшее культивирование проводят 3 ч при 37 С для экспрессии урокинаэ- ного гена.
Из жидких сред экстрагируют и очи- щают 5 мл среды на основе плазмиды ptrpUK2 ((135Д157) с получением му- тантного проурокиназо-подобного поли- пептида (Q135/J157). Часть полипепти- да обрабатывают трипсином следующим образом.
После определения ферментной активности по методу синтетического субстрата пробы разбавляют раствором, содержащим 50 мМ трис-НС1 буфера (рН 7,4), 0,15 К хлористого натрия и 0,1% тритона X-100 до конечной концентрации 100 МЕ/мл. К 50 мкл добавляют 3 мкл водного раствора трипсина до окончательной концентрации 1 мг/мл 2 мг/мл и 3 мг/мл и смеси инкубируют при 37 С в течение 60 мин. Затем ре акцию прекращают добавлением 5 мкл соевого ингибитора трипсина. В качестве контроля аналогично обрабатывают пробы, содержащие вместо трипсина воду.
Пробы подвергают электрофорезу в градиентном полиакриламидном геле (10-26%)., Гель погружают в 2,5% три- тон Х-ЮО и инкубируют в течение часа при комнатной температуре, наслаивают на фибрино-агаровую пластинку и инкубируют 2 ч при 37°С. Молекулярную массу оценивают на основании положения зоны растворения на фибрин-агаровой пластинке.
Также обрабатывают проурокииазо- подобный полипептид природного типа
0
5 0 5
g
5
,и мутантный проурокиназо-подобный полипептид (0135), полученньм зкст-
-ракцией и очисткой жидкой среды, полученной в примере 25, с помощью методики примера 27« Молекулярная масса проурокиназы природного типа на основе pMUPI составляет около 50.000, диссоциация трипсином снижа- ет ее до 30.000. С другой стороны никакой конверсии до низкомолекуляр- ного материала не происходит при обработке трипсином в случае полипеп- тидов на основе соответственно плаз- мид pMUFIpm и ptrpUK2 ((135Д157). Характеристика штаммов хозяев Общие свойства.
1 о Длинные стержни размерами 1,1- 1,5 на 2,0-6,0 мкм (живые) или 0,4- 0,7 на 190-3,0 мкм (высушенные и окрашенные) о
Д (lac pro), thi, str A, supE, end A, sheA, she B, usd 1, F tra П 36, pro AB,. lac If , Z ДМ15
Специфические свойства Escherichia coli / pMUPIpm2 (FERM BP-969) - проду- цент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, со следующей аминокислотной последовательностью: (Met) - Ser - X - Y-, где X - глутамин в положении 135 и Y-фенилаланин в положении 157
Escherichia coli / pMUT4Lpr.2 (FEPM ) - продуцент полипептида, об- ладающего свойствами человеческой проурокиназы со следующей аминокислотной последовательностью: (Met) - Ser - ;Х - Y-, где X представляет собой треонин в положении 135,aY-фенилала- нин в положении Т57„
Escherichia coli / ptrpUK2 (QU157) (DSM - 3623) - продуцент полипептида, обладающего свойствами человеческой проурокиназы, где X представляет собой глутамин в положении 135, a Y - аспарагиновую кислоту в положении 157.
Проурокиназа, полученная с помощью E.coli W3110 и трансформированная с помощью pMUPIpro,, составила примерно 2 мкг/мл, полученная с помощью E0coli ШЮЗ, трансформированной с помощью PMVT4Lpra2, составляет от 5 до 10 мкг/мл, а полученная с помощью E.coli W311О,.трансформированной с
10
помощью pKWpIpm, составила примерно от 1 до 2 миг/мл
Формула изобретения
до 42 С образования полипептида со 25 следующей аминокислотной последовательностью:
|Met| - Ser - Gin - Phe 2.Штамм бактерий Escherichia coli FEKM BP-9b9 - продуцент полипептида зо со свойствами проурокиназы и аминокислотной последовательностью:
|Met| - Ser-Gin135- Phe 57-. 3. Способ получения полипептида со свойствами проурокиназы, предус- мятривающий конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК, обеспечиваюей синтез проурокиназы, трансформацию рекомбинантной ДНК штамма бактеий Escheri chia colij отбор клонов, культивирование штаммов, индукцию образования полипептида, выделение очистку целевого продукта, отлиающийся тем, что, с целью овышения стабильности полипептида, онструируют рекомбинантную плазмид-
35
40
Признак (1)
Подвижность
Индол
на TSI
2 Талакто-
зидаза
Лактоза
Мукат
0
0
5
о
5
0
- Ser - ThrW- Phe 57ную ДНК pMUT4Lpm2, трансформируют полученной ДНК штамм бактерий К„coli , культивируют трансформирогшн-i ные клоны при 37°С и путем прибавления изопропил-ЯН)-тиогалактопиранози- да индуцируют образование полипептида. со следующей аминокислотной последовательностью:
|Met|
и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности полипеп- тида, конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК ptrpUK2 - (0135D 157) трансформируют полученной ДНК штамм бактерий E.coli W3110, культивируют трансформированные клоны при температуре 37 С и путем прибавления ин- долуксусной кислоты индуцируют образование полипептида со следующей аминокислотной последовательностью: Met|-Ser-Gln 3 -Asp 57
(Met(-Ser-(;in S5-Asp157 .
Приоритет по пунк - там:
Т а б л и ц а 1
Наличие (+), отсутствие (-) (II)
+ +
+
+/х +
23
Признак (1)
KCN
Желатин Малонат d-Тартрат Дульцитол
Каталаза
Оксидаза
й-Талактоэидаэа
Газ из глюкозы
при 37° С
KCN (роста)
Мукат (кислота)
Восстановленный
нитрат
G-C, мол. %
Адонитол
Арабиноза
Лактоза
Мальтоза
Маннит
Салицин
Сорбит
Трелалоза
Близкие углерод
источники
Цитрат
Малонат
M.R.
У.Р.
Гидролиз желати
H2S из TS I
Кндол
Декарбоксилировньв1 лизин
Т идролизованная
мочевина
Глутаминовая ки
Фенилаланин
169582724
Продолжение табл,1
Наличие (+), отсутствие (-) (II)
d (аналоги) d - Таблица 2
+ 50+51
+ + + + f + +
или X
