Способ получения полипептида со свойствами фактора некроза опухоли Советский патент 1992 года по МПК C12N15/28 

Изобретение относится к области медицины и биологии и может быть использовано для получения человеческого фактора некроза опухолей (ФНО).

Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности in vivo, при низкой цитотоксической активности In vitro.

Способ заключается в том, что конструируют плазмиды pHTP16V. pHTP31T, pHTP32S. pHTP32D. рНТР32Н. pHTP36V, РНТР73Р. рНТР98Н, рНТРЮЗР. рНР1-115, рНМУ-32. рНТР115Н. pHTP115D, pHTP115S. pHTP115G, рНТР115Т, pHtP117H, pHTP1311, pHTP143V, трансформируют ими штамм E.coll HB 101 культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.

Пример 1. Построение экспрессион- ной плазмиды рНМУ-32.

Клонированную кДНК, кодирующую человеческий ФНО, выделяют обработкой эндонуклеазами рестрикции Pst1, используя рекомбинантную плазмиду pHTNF13, полученную по методике, описанной в Европейской патентной публикации № 155549.

Клонированную кДНК дополнительно обрабатывают зндонуклеазами рестрикци- онными Ava t и Hind tl для выделения ДНК фрагмента, содержащего основную часть области кодирования полипептида человеческого ФНО. Выделенный ДНК-фрагмент называют ФНО-ДИК-фрагментом.

ФНО-ДНК-фрагмент имеет размер около 600 п.о.

ФНО-ДНК-фрагмент затем обрабатывают эндонуклазой рестрикции эндонуклеаз Нра II и Bgl II для разрезания его на три ДНК-фрагмента. Фрагменты выделяют. Эти ДНК-фрагменты названы, соответственно фрагмент ДНК-1, фрагмент ДНК-2 и фрагмент ДНК-3.

Затем фрагменты ДНК-1 и ДНК-3 комбинируют, используя Т4-ДНК-диагазу со спеN3

Ы

дующим химическим синтезированным оли- годезоксирибонуклаостидным адаптером

(а)

5 -CGGGCCTATGCCCTCC-3 3 -CCGGATACGGG-5Свйзанный ДНК-фрагмент именуют фрагментом NY-ДНК. Фрагмент NY-ДНК последовательно связывают со следующими двумя химически синтезированными олиго- дезоксирибонуклеотидными адаптерами (Ь) и (с)

(b)5 -AACTAGTACGCAAGrTCAGGTAAGGAGGTTATC-3

3 -TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGCTA-5

(c)5 -GATTATGTCATCTTCl CGAACC-31

3 -ATACAGTAGAAGAGCTTGGGGGT-5

Результирующий ДНК-фрзгмент именуют пептидо-кодирующим ДНК-фрагментом.

ДНК-фрзгмент (размером около 380 п.о.), содержащий trp промоторную область, выделяют из плазмиды рСТ-1 с помощью двойной обработки эндонуклеазами Нра I и Aat И. Последовательность оснований trp- промоторной области указанного ДНК- фрагмента в 380 п.о. известна. Указанный ДНК-фрагмент 380 из п.о. связывают с пептидо-кодирующим ДНК-фрагментом, как это описано выше. Связанный ДНК фрагмент именуют промотор-пептидокодирую- щим ДНК-фрагментом.

Отдельно от этого, плазмиду pBR322 обрабатывают эндонуклеазами рестракции Ava I и Pvu II, и результирующий ДНК-фрагмент (размером околи 3,7 т.п.о.) выделяют с помощью гельзлектрофореза в 0,7% агаро- зе. После заполнения области между его липкими концами и тупыми концами с использованием ДНК-полимеразы 1 Е.соП (фрагмент Кленова) и четырех видов дезок- сирибонук л еоти дотри фосфатов (дГТФ, дАТФ, дТТФ и дЦТФ), оба конца связывают с помощью Т4-ДНК-лигазы для построения новой плазмиды, которая обозначена PBRS6.

Плазмиду pBRS6 расщепляют эндонуклеазами растрикции Aat II и Hind III на два ДНК-фрагмента. ДНК-фрагмент (размеры около 3,6 т.п.о) выделяют и связывают с помощью Т4-ДНК-лигазы с промогорпеитидо- кодирующим ДНК-фрагментом, полученным выше, для построения зкспрессионной плазмиды pHNY-32. Для получения полипептида ФНО-32У, содержащего 155 аминокислот, и с аминокислотной последовательностью, в которой аспарагиновый остаток в 32-ом положении от N-конца заменен тирозином (Туг).

2. Получение ФНО-32У

Экспрессионную плазмиду pHNY-32 вводят в E.coli HB101 обычным способом (S.N.Cohen и др.. Proc, Natl. Acad. Sci США, 69.2110(1972)).

Трансформант (HB101)pHNY-32) культивируют при 37°С около суток в LB-бульоне (состав: 1 % триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCi, pH 7,5). Культурой инокупируют 10 объемов среды М9 (состав: 1,5% N32HP04-12H20. 0.3% КН2Р04. 0,05% NaCI. 0,1% , 2 мг/л витамина В1, 0,45% ка- заминокислоты, 1 мМ Мд$04, 0,1 мМ CaCl2 и 0,4% глицерина), содержащей ампициллина в концентрации 25 мкг/мл (37°С, 1 ч).

Затем добавляют 3-индолакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мл. После этого культивирование продолжают еще 24 ч и клетки отделяют центрифугированием. Полученные клетки суспендируют в 50 мМ буфера Трис-ИС (рН 8), содержащего 0,1% лизозима и 30 мМ NaCI, и оставляют на 30 мин на ледяной бане. После неоднократной обработки клеточной суспензии замораживанием в бане с сухим льдом в этаноле и оттаиванием при 37°С клеточный экстракт отделяют центрифугированием.

Клеточный экстракт диализуют относительно 20 мМ буфера Трис-НС (рН 7,8) и

центрифугированием диализата получают осветленную жидкую часть. Жидкую часть наносят на колонку с ДЭАЗ-Сефарозой CL- 6В (фармация), предварительно уравновешенную 20 мМ буфером Трис-HCI (рН 7,8).

После промывания колонки тем же буфером с целью удаления неадсорбированных компонентов целевой полипептид (ФНО-32У) злюируют в условиях линейного градиента концентрации NaCI от нуля до 0,3 М в том

же буфере. Каждую фракцию подвергают электрофорезу на НДС-полиакриламидном геле и фракции, содержащие полипептид с молекулярным весом около 17 килодальтон, собирают и объединяют. Объединенные

фракции диализуют относительно 20 мм буфера Трис-HCI (рН 7,8) и вновь подвергают колоночной хроматографии на ДЭАЭ-Сефа- розе CL-6B в вышеприведенных условиях, но с элюированием более легким градиентом концентрации NaCI.

Содержащие целевой полипептид фракции собирают, объединяют и концентрируют ультрафильтрованием с Диафло на мембранах УМ 10 (Амико).

И наконец, концентрат подвергают гельфильтрации на колонке Биогель Р-6 (Био-Рад) с применением в качестве элюен- та 5 мМ фосфатного буфера в солевом рас- таоре и получением очищенного ФНО-32У (выход 20,8 мг/л).

N-концевую аминокислотную последовательность очищенного ФНО-32У с помощью автоматического разложения по Эдм-ну на приборе для определения аминокислотных последовательностей (Эпплайд Виосистемс. модель 470А).

В результате установлено, что N-конце- вой аминокислотой ФНО-32У является остаток серина, т.е. метиониновый остаток, обусловленный кодоном запуска тринслл- ции (АТС) удален из очищенного продукта.

Пример 2.1. Построение зкспресси- онной плазмиды рНРЫ 15.

ФНО-ДНК-фрагмент, полученный в примере 1 (1), обрабатывают эндонуклеаза- ми Pvu II и Tag I для разрезания его на четыре ДНК-фрагмента. Фрагменты выделяют.

Эти ДНК-фрагменты именуют, соответственно, фрагмент ДНК-4, фрагмент ДНК-5, фрагмент ДНК-б и фрагмент ДНК-7. Фрагмент ДНК-5 дополнительно обрабатывают эндонуклеазой Ddlf и получают ДНК-фрагмент именуемый фрагментом ДНК-8.

Фрагмент ДНК-8 комбинируют с фрагментом ДН К-4, а затем связывают со следующими двумя химически синтезированными олигодезоксирибонуклеотидными адаптерами (d) и (е).

(d) S -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT- 3

3--CCGGTTCGGGACCATACTCGA-51 И

(е) 5 -CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG-3p 3--GTAGATAGACCCTCCCCAGAAAGGTC-5

К полученному ДНК-фрагменту, используя Т4-ДНК-лигазу, дополнительно привязывают фрагмент ДНК-6 и фрагмент ДНК-7. Результирующий ДНК-фрагмент именуют PL-ДНК-фрагментом.

Экспрессионную плазмиду pHPL-115 строя по методике примера 1, но вместо NV-ДНК-фрагмента используют PL-ДНК- фрагмент.

2. Получение ФНО-1151.

По методике примера 1-(2) получают трансформант HB101(pHPL-115).

Тра нсформант (НВ101(рНРЫ15) культивируют в течение ночи при 30°С в бульоне LB (состава: 1 % триптона. 0,5% дрожжевого экстракта, 1% NaCI, pH 7,5). Культуру иноку- лируют в 10 объемах модифицированной среды М9 (1,5% Na2HP04-12H20, 0,3% КН2РО4. 0,05% NaCI. 0.1% МЩС, 2 мг/л витамина В1,0,45% касаминовой кислоты, 1 мМ MgaSO, 0,1 мМ CaCIa и 0,4% глицерина) содержащей ампициллин в количестве 25 мкг/мл. при 37°С в течение 1 ч.

Затем добавляют 3-индолакриловую кислоту до конечной концентрации 20 мкг/мл. После этого культивирование дополнительно продолжают в течение 24 ч. клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 50 мМ буфера трис-HCI (рН 8), содержащего О 1 % лизоцима и 30 мП .l и оставляют в

ледяной ванне в течение 30 мин После этого суспензию клеток многократно обрабатывают замораживанием (сухой лед-этанол) и оттаиванием (при 37°С), клеточный экстракт

собирают центрифугированием.

Клеточный экстракт диализуют в буфере 20 мМ трис-HCI (рН 7,8), диализат центрифугируют. Йадосадочную жидкость наносят на колонку ДЭАЗ-Сефзроза CL-6B, предвари0 тельно уравновешенную с помощью 20 мМ буфера трис-HCI (рН 7,8). После промывки колонки тем же буфером для удаления неадсорбированных компонентов, требуемый полипёптид элюируют с использованием

5 линейного градиента концентрации NaCI от О до 0,3 М в том же буфере. Каждую фракцию подвергают ДСН-полиакриламидному гель- электрофорезу и фракции, содержащие полипептид, имеющий молекулярную массу

0 около 17 килодальтонов, собирают и объединяют.

Объединенную фракцию диализируют относительно 20 мМ буфера трис-HCI (рН 7,8), а затем ее снова подвергают хроматог5 рафии в колонке ДЭАЭ-сефароза CL-бВ описанным образом, но элюирование проводят в условиях более слабого градиента концентрации Nad.

Фракции, содержащие целевой пол0 ипептид собирают, объединяют и концентрируют с помощью аппарата Диафлоу с использованием мембраны УМ 10.

Наконец, концентрат подвергают гель- фильтрации на колонке Бзйо-Гель Р-6 с

5 использованием содержащего фосфатный буфер солевого раствора в качестве элюен- та для получения очищенного ФН02-1 t5L

3. Определение аминокислотной последовательность.

0 Аминокислотные последовательности очищенного OHO-115L и его пептидного фрагмента анализируют с помощью автоматизированного разложения по Эрдману на приборе для определения последовательно5 сти аминокислот в белках.

Пептидный фрагмент получают в следующих условиях, 500 мкг очищенного ФНО-115L инкубируют с 10 мкг лизил-эндо- пептидазы в 5 мМ буфера трис-HCI (рН 8),

0 содержащего 4 М мочевину в общем обьеме 0,1 мл. После инкубирования при 35°С в течение 15 ч, результирующие переваренные пептиды выделяют высокоэффективной жидкостью и хроматографией, в условиях

5 линейноградиентного элюирования от 10% до 50% ацетонитрила, содержащего 0,07% трифторуксусной кислоты, в 0,1% трифто- руксусной кислоте, при расходе 1 мл/мин в течение 60 мин. Пептидные фрагменты выделяют из каждой фракции и подвергают ИУ

аминокислотные последовательности анализу с помощью метода автоматического разложения по Эдману.

Подтверждено, что аминокислота в положении 115 от L-конца ФНО-115L является лейциновым остатком.

N-концевая аминокислота очищенного ФНО-115L является сериновым остатком, что указывает на удаление метионинового остатка, обусловленного кодоном запуска трансляции (АТС).

Пример 6. Получение других полипептидных мутантов-1 человеческого ФИО,

1.Построение экспрессионных плаз- мид.

Экспрессионную плазмиду для получения полипептида, состоящего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, в которой аспарагино- вый остаток в положении 32 от N-конца за- менен другой аминокислотой, например His, Asp и Ser строят по методике примера 2-{1), за исключением того, что вместо синтетического адаптера (а) используют один из приведенных ниже химически синтези- ровэнных Олигодезоксирибонуклеотидных аде п торов:

5 -CGGGCCCACGCCCTCC-3

3 -CCGGGTGCGGG-5

(для замены остатком His)

S -CGGGCCGATGCCCTCC-S

3 -CCGGCTACGGG-5 (для замены остатком Asp) или

5 -CGGGCCAGCGCCCTCC-3

3 -CCGGTCGCGGG-5

(для замены остатком Ser).

Эти плазмиды обозначены как соответственно: рНТР32Н. pHTP32D. pHTP32S.

2.Получение полипептидного мутанта человеческого ФНО.

Каждую из экстрессионных плазмид, полученных в разделе 1. вводят в E.coll НВ101 традиционным методом, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид очищают от клеточного экстракта по методике примера 2-(2).

Пример 7. Получение других полипептидных мутантов-2 человеческого ФНО.

1. Построение экспрессионных плазмид.

Экспрессионную плазмиду для получения полипептида, состоящего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, в которой пролиновый остаток в 115-м положении от N-конца заменен другой аминокислотой, например Ser, Asp и Gly строят по методике примера 2-(1): за исключением использования одного из

химически синтезированных Олигодезоксирибонуклеотидных адаптеров, приведенных ниже, вместо синтетического адаптера (d): 5 -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGTCCAT-3

S -CCGGTTCGGGACCATACTCAG-S (для замены остатком Ser) S -TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGACAT-S1

S -CCGGTTCGGGACCATACTCCC-S1 (для замены остатком Asp) 5--TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGGCAT-3

S -CCGGTTCGGGACCATACTCCC-S (для замены остатком Gly).

Эти плазмиды обозначены как pHTP115S. pHTP115D. pHTP115G1. соответственно.

2. Получение полипептидных мутантов человеческого ФНО.

Каждую из экспрессионных плазмид. полученных в разделе 1 вводят в E.coli НВ101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-{2).

Целевой полипептид выделяют и очищают из клеточного экстракта по методике примера 2-(2).

Пример 8. Получение полипептидного мутанта ФНО 117Н-человеческого ФИО. обозначенного ФНО-117Н,

1.Построение зкспрессионных плазмид.

Экспрессионную плазмиду для получения полипептида, состоящего из 155 аминокислот и имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности от аминокислоты N 1 до № 155 в табл.1, в которой тирозиновый остаток в 117-м положении с N-конца заменен на другую кислоту, например His строят по методике примера 2-(1), за исключением использования приведенного ниже химически синтезированного олигодезоксирибонукле- отидного адаптера вместо синтетического адаптера (е):

S -CCATCTGGGAGGGGTCTTCCAGrS 3M3TAGGTAGACCCTCCCCAGAAGGTC-51 Данная плазмида обозначена как РНТР117Н.

2.Получение ФНО-117Н Экспрессионную плазмиду, полученную в разделе(1) вводят в E.coli HB101 обычным путем, и трансформант культивируют по методике примера 2-(2).

Целевой полипептид выделяют и очищают из клеточного экстракта по существу по методике примера 2-(2).

Пример 9. Получение других полипептидных мутантов ФНО человека.

По методике примера 2-(1) конструиру- ют экспрессионные плазмиды. рНГР1бдля получения ФНО-16У, рНТКШ Лпч ФИО

31Т, HTP36V - для OHO-36V, pHTP73P - для ФНО-73Р. рНТР98Н - для ФНО-98Н, рНТР103Р-дляФНО-103Р,рНТР115Т-для ФНО-115Н, рНТР115Н - для ФНО-115Н, рНТР1311-дляФНО-1311 ирНТР143-для ФНО-143У, которыми трансформируют Escherlchla coli. Трансформанты культивируют и затем полипептиды выделяют и очищают по методике примера 2-(2) со следующими результатами:

CPHO-16V - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 16-ый Ala заменен Val (выход 17,5 мг/л);

ФНО-31Т - полипептид с аминокислот- ной последовательностью формулы (1), в которой 31-ый Ala заменен Thr (выход 26,4 мг/л);

ФНО-36У - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в ко- торой 36-ой Ala заменен Val (выход 8,9 мг/л):

ФНО-73Р - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 73-ий Leu заменен Pro (выход 2,1 мг/л);

ФНО-98Н-полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 98-ой Pro заменен His (выход 3,2 мг/л);

ФНО-ЮЗР - полипептид с аминокис- лотной последовательностью формулы (1), в которой 103-ий Thr заменен Pro (выход 15,9 мг/л);

ФНО-115Т - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ый Pro заменен Thr (выход 20,5 мг/л);

ФНО-115Н - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 115-ый Pro заменен His (выход 23,2 мг/л);

ФНО-1311 - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1), в которой 131-ый Ser заменен Не (выход 17 мг/л);

ФНО-143 - полипептид с аминокислотной последовательностью формулы (1). в которой 143-ий Ala заменен Val (выход 16,5 мг/л).

Формула изобретения

Способ получения полипептида со свойствами фактора некроза опухоли, предусматривающий конструирование реком- бинантной плазмидной ДНК с мутацией в гене, кодирующем фактор некроза опухоли, трансформацию полученными ДНК штаммов Escherichia coli, культивирование, выделение и очистку конечного продукта с

последующим определением аминокислотной последовательности и целевого белка, отличающийся тем, что, с целью повышения противоопухолевой активности In vivo, при низкой цитотоксической активности In vitro конструируют рекомбинант- ные плазмидные ДНК pHTP16V, pHTP31T, pHTP32S pHTP32D. рНТР32Н. рНМУ-32, pHTP36V, pHTP73P, pHTP98P, pHTP103f pHPL-115, pHTP115H, pHTP115D. PHTP115S, pHTP115G, pHTP115T, pHTP117P, pHTP1311 или pHTP143V, трансформируют плазмидами бактерии штамма Escherlchla coll HB101, а очистку целевого продукта осуществляют нанесением клеточного лизата на колонку с ДЭАЭ-Сефарозой. уравновешенную 20 мМ трис-HCI буфером при рН 7,8, элюирование проводят с помощью линейного градиента концентрации NaCI от 0 до 0,3 М в том же буфере, затем осуществляют полиакриламидный гельзлек- трофорез. полученную фракцию диализуют с помощью 20 мМ буфера трис-HCI рН 7,8 и наносят на колонку с ДЭАЗ-Сефарозой, а элюирование проводят с помощью слабого градиента NaCI, элюат концентрируют, концентрат подвергают очистке гельфильтрацией с использованием фос- фатсодержащего буфера в качестве злюен- та, при этом целевой белок характеризуется следующей аминокислотной последовательностью:

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Va Ala Asn Pro Glu Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Aro Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ara Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu lie Tyr Ser Glu Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr lie Ser Arg jle Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala le Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pso lie Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Aro Leu Ser Ala Glu jle Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly lie fie Ala

с заменой 16-й аминокислоты Ala на Val 31-ой - -Ala- - Thr 326-ой Asn Asp, His, Ser или Туг 36-ой Ala Val 73-ей Leu Pro 98-ой 103-ей - -Thr- -Pro 115-ой - -Pro- - Leu, His, Ser, Gly. Asp или

117-ой-н-Туг- -His 131-ой- -Ser- - lie 143-ей- -Ala- -Val

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для получения человеческого фактора некроза опухолей (ФИО). Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности In vivo при низкой цитотоксиче- ской активности in vitro. Способ заключается в том, что конструируют плазмиды pHPL-115, pH PL147, pHPL-Ser. трансформируют ими штамм бактерий E.coll HB 101, культивируют штаммы с последующим выделением и очисткой целевого продукта.