Способ культивирования ткани кукурузы Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию тканей растений in vitro, а имеено к способам индукции каллусообразования у злаков, являющейся этапом при регенерации растений путем побегового морфогенеза и соматического эмбриогенеза в культуре ткани злаков и позволяющей получать измененные генотипы вследствие спонтанной сомаклональной и индуцированной мутационной изменчивости клеток.

Цель изобретения - повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности.

Способ состоит в том, что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-бисдиазоацетилбутан (ДАБ) в количестве 1-10 мг/л (ДАБ известен как мутаген). Проведенные исследования показали возможность использования его как стимулятор каллусообразования.

Способ осуществляется следующим образом.

После стерилизации и промывки початков вычлененные незрелые зародыши инкубируют в течение 1 ч в жидкой питательной среде МС с ДАБ. Затем тща

Цельно трижды отмьшают жидкой пита- ельной средой. Для хранения вычле- ijieHHbix зародышей, обработки зародьше kAБ и отмывки от него используют жид kyro питательную среду, но без 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4 Д аминокислот и агара. Обработка раст- иорами ДАВ проводится в чашках Петри при комнатной температуре. Культи- нируют по два зародыша в пробирках i; 10 мл среды при 27 ± и 16-ча- ювом фотоперирде. В качестве стимулятора каллусообраЗования используют 1А.Б в количестве 1-100 мг7л среды. 1 аточный раствор ДАВ стерилизуют пропусканием через бактерицидный фильтр. Твердая питательная среда для индукции каллуса содержит 0,25 мг/л 2,4 Д.

Пример 1. Незрелые початки пинии ВС2923, взятые на критический 16-й день после цветения, поверхностно стерилизуют лабораторным детегентом, трижды промывают стерильной водой. Вычленяют из зерновок незрелы |заррдыши, удаляют эндосперм. Далее Ь1езрелые зародьши переносят на твердую культуральную среду и размещают щитком вверх. Каллус инициируют и сохраняют на модифицированной среде МС, содержащей неорганические компоненты по Мурасиге и Скугу, витамины

и аминокислоты по Штраусу, 20 г/л

Пример 7. Условия проведе|сахарозы, 8 г/л агара. Индукция каллу-, ния опыта аналогичны описанным в

I.- JJ

|сообразования достигается при использовании в качестве стимулятора роста Iгербицида 2,4 Д в концентрации

примере 6, однако количество ДАВ составляет 10 мг/л. Общая величина каллусообразования 13,62 + 6,25 .21,87%. 0,25 мг/л. Через 28 дней культивиро- Пример 8. Условия проведения |вания проводят учет.. Данные представ-40 опыта аналогичны описанным в примере ;лены в табл.1. Каллусообразование , 6, однако количество ДАВ составляет ;отсутствует, наблюдается лишь про- ЮО мг/л. Общая величина каллусообра- :растание зародышей.зован.ия 3,12 + 15,62 18,84%. ВедуПример 2. Условия проведения щей реакцией зародьш ей является про- опыта аналогичны описанным в приме- межуточная, собственно к ллусообразо-.

50

ре 1, однако перед посадкой зародышей для культивирования на твердую питательную среду, помещают их на 1 ч в жидкую питательную среду, содержащую 1 мг/л ДАВ. Затем отмывают жидкой питательной средой без ДАВ. При этом наблюдается каллусообразование 24,13%, корнеобразование и прорастание зародьш1ей.

Пример 3. Условия проведения гс опыта аналогичны описанным в примере ;2, однако количество ДАВ составляет 10 мг/л. При этом наблюдается увеличение общего каллусообразования

вание составило 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах 6 и 7.

П р и м е р 9. Условия проведения опыта соответствуют описанным в примере 1, но возраст незрелых зародышей скороспелой линии ВС 2923 составляет 18 дней после опыления. Каллусообразование отсутствует, наблнщается лишь прорастание зародышей. .

Пример 10. Условия проведений опыта аналогичны описанным в примере 2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАВ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается появление

0

5

до 20,68 + 13,79 34,47% за счет промежуточной реакции между собственно каллусообразованием и прорастанием: одновременного формирования каллуса и недоразвитого побега. Недоразвитый побег отделяют, а оставший ся каллус можно культивировать дальше.

Пример 4. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 2, однако количество ДАВ составляет 100 мг/л. Ёедущей реакцией является промежуточная реакция, собственно 5 каллусообразование составляет 2,85%, что на порядок меньше, чем в примерах . 2 и 3.

Пример 5. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

1,но возраст незрелых зародьш1ёй скороспелой линии ВС 2923 составляет 17 дней после опыления. Калл сообра- зование отсутствует, наблюдается лишь прорастание зародьш1ей.

Пример 6. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере

2,возраст зародьш1ей 17 дней (табл;2). Содержание ДАВ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается

0 появление каллусообразования, промежуточной реакции, корнеобразования. . Общая величина каллусообразования 21,72 + 3,12 24,84%.

Пример 7. Условия проведе0

0

с

вание составило 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах 6 и 7.

П р и м е р 9. Условия проведения опыта соответствуют описанным в примере 1, но возраст незрелых зародышей скороспелой линии ВС 2923 составляет 18 дней после опыления. Каллусообразование отсутствует, наблнщается лишь прорастание зародышей. .

Пример 10. Условия проведений опыта аналогичны описанным в примере 2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАВ в жидкой питательной среде 1 мг/л. При этом наблюдается появление

каллусообразования промежуточной реакции, корнеобразования. Общая вели-, чина каллусообразования 18,75 + 6,25 25%.

Пример 11. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАВ 10 мг/л. Общая величина каллусообразования 15,62 + 12,50 28,12%г| обработку зародышей перед культивироПример 12. Условия проведения опыта аналогичны описанным в примере 2, возраст зародышей 18 дней, содержание ДАВ 100 мг/л. Общая величина каллусообразования 3,12 + 9,37 12,49 %. Ведущей реакцией зародышей является промежуточная, собственно каллусообразование 3,12 %, что значительно меньше, чем в примерах 10 и 11.

Таким образом обработка незрелых зародьш1ей скороспелой линии ВС 2923 ДАВ в количестве 1; 10 и 100 мг/л расширяет спектр ростовых реакций незр1елых зародышей критического для данной линии 16-дневного и старшего возраста и обеспечивает возможность

получения каллуса еще в течение 2-3 дней. Кроме наблюдаемых в контроле прорастания и прекращения развития зародьшгей в вариантах с обработкой ДАВ отмечены каллусообразование, промежуточная реакция (формирование

одновременно каллуса и недоразвитого побега), интенсивное корнеобразование Калпус индуцируется двух типов: рых- . лый, светло-желтый с участками позеленения, из которого в дальнейшем возможна регенерация растений, т.е. .тотипотентный и плотный компактный белый. Образование тотипотентного морфогенного каллуса чаще наблюдается

-при содержании ДАВ 1-10 мг/л.

При содержании ДАВ 100 мг/л преобладает образование неморфогенного

ванием мутагеном ДАВ в количестве 1-10 мг/л более эффективен по сравнению с известным, так как позволяет увеличить в два раза временной проме)5 жуток для введения в культуру незрелых зародьшей кукурузы, обеспечивает при зтом изменение спектра ростовых реакций зародышей определенного возраста и получение тотипотентного

20 каллуса, что возволяет повысит эффективность селекционной работы на клеточном уровне.

30

35

40

о р м у л а

изобретения

2545

Способ культивирования ткани кукурузы , включающий вычленение зародышей из простерилизованного початка, перенесение их на модифицированную, твердую питательную среду Мурасиге- Скуга, содержащую в качеств.е стимулятора каллусообразования 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту, к дальнейшее их культивир ование, отличающийся тем, что, с -целью повьшгения индукции каллусообразо - вания и .регенерационной способности, перед нанесением зародышей на твердую питательную среду производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой модифицированной питательной среде Нурасиге-Скуга, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-диазоцетилбутан в количестве 1-10 мг/л.

белого плотного каллуса, полученного в основном от зародышей, для которых характерна промежуточная реакция между собственно каллусообразованием и прорастанием.

Таким образом, предлагаемый способ индукции каллусообразования из незрелых зародышей кукурузы, включающий

ванием мутагеном ДАВ в количестве 1-10 мг/л более эффективен по сравнению с известным, так как позволяет увеличить в два раза временной промежуток для введения в культуру незрелых зародьшей кукурузы, обеспечивает при зтом изменение спектра ростовых реакций зародышей определенного возраста и получение тотипотентного

каллуса, что возволяет повысит эффективность селекционной работы на клеточном уровне.

о р м у л а

изобретения

2530

35

40

45

Способ культивирования ткани кукурузы , включающий вычленение зародышей из простерилизованного початка, перенесение их на модифицированную, твердую питательную среду Мурасиге- Скуга, содержащую в качеств.е стимулятора каллусообразования 2,4- дихлорфеноксиуксусную кислоту, к дальнейшее их культивир ование, отличающийся тем, что, с -целью повьшгения индукции каллусообразо - вания и .регенерационной способности, перед нанесением зародышей на твердую питательную среду производят дополнительное инкубирование их в той же жидкой модифицированной питательной среде Нурасиге-Скуга, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-диазоцетилбутан в количестве 1-10 мг/л.

Ростовые реакции незрелых зародышей кукурузы после обработки ДАВ

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии , в частности, к культивированию тканей растений IN VITRO. Целью изобретения является повышение индукции каллусообразования и регенерационной способности. Способ состоит в том, что перед перенесением зародышей на модифицированную твердую питательную среду Мурасиге-Скуга производится дополнительное инкубирование их в той же жидкой питательной среде, в которую в качестве стимулятора каллусообразования вводят 1,4-диазоцетилбутан в количестве 1-10 мг/л. 2 табл.

Влияние возраста незрелых эародьппей линии ВС2923 на индукцию каллусообразования

Данные об изолированных эародьппах

Возраст, дни

Длина, мм

1,0 - 1.2 1,0 - 1,5 1,5 - 2,0 2,0 - 2,5 2,5 - 3,0

Таблица 2

Каллусообраэование, Z

2,0

Количество -2,4 Д (мг/л)

J

40,6

50,00

46,15

38,12 18,18 11,53

9,36 9,09