Способ определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных Советский патент 1992 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток животной ткани на микроносителях.

Принцип выращивания клеток животной ткани на микроносителях является одним из наиболее перспективных, поскольку позволяет значительно повысить выходы клеток, по сравнению с традиционными способами монослойного культивирования.

При практической реализации этого принципа встречаются определенные трудности, связанные, в части ости с тем. что при одинаковых условиях культивирования выходы клеток могут значительно варьировать. Весьма ощутимо могут изменяться выходы клеток и при использовании микроносителей разных классов, и при использовании различных серий одного и того же микроносителя. По этой причине освоение метода культивирования клеток животной ткани на микроносителях требует широкомасштабных предварительных исследоваий по подбору приемлемых микроносителей для каждой клеточной линии.

Известен способ определения пригодности микроносителей для культивирования клеток животной ткани, заключающийся в том. что клетки выращивают на микроносителе и в зависимости от полученного результата делают вывод о пригодности или непригодности данного микроносителя.

Однако этот прямой метод определения является длительным, так как осуществляется в течение 2-3 сут (время цикла культивирования) и не позволяет во всех случаях делать однозначный выводе непригодности микроносителя, поскольку отсутствие клеточного роста или слабый клеточный рост могут обуславливаться причинами, не связанными с качеством и природной испытуемого микроносителя.

Цель изобретения - сокращение времени определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных и повышение достоверности результатов.

Поставленная цель достигается в результате того, что испытуемый микроноситель подвергают инкубации в растворе соли

№

О

СО

О

со

ел

кальция определенной концентрации, отделяют взвешенные частицы микроносителя, в фильтрате определяют концентрацию ионов кальция, определяют количество сорбированных ионов и по этой величине судят о степени пригодности микроносителя для культивирования клеток животной ткани.

Сущность предложенного способа заключается в том, что предварительно гото- вят раствор соли кальция определенной концентрации и диспергируют в этом растворе навеску испытуемого микроносителя. После некоторого времени инкубации взвешенные частицы удаляют фильтрованием. центрифугированием или иным методом, а в фильтрате определяют концентрацию ионов кальция. Вычисляют убыль кальциевой соли за счет адсорбции на микроносителе и полученную величину рассматривают как показатель пригодности микроносителя для культивирования клеток животной ткани.

Используемый раствор соли кальция может иметь различную концентрацию, но удобнее готовить 0,1 М раствор.

Испытание можно проводить в различном объеме, но наиболее оптимальным является объем 50 мл.

Количество микроносителя, предназначенное для исследования, может колебаться в самых различных пределах, в среднем на объем 50 мл раствора кальциевой соли достаточно 1,5 г микроносителя.

В качестве кальциевой соли может быть использована любая водорастворимая соль.

Длительность инкубации, как и другие количественные характеристики, не имеет особого значения, однако для исследования достаточно 60 мин.

Метод определения от раствора взвешенных частиц микроносителя не имеет принципиального значения.

Инкубация микроносителя в растворе желательна в условиях, близких к условиям культивирования клеток животной ткани на микроносителе, т.е. ее можно проводить при оптимальных для культуры клеток температуре и режиме перемешивания. Однако это условие не является обя- зательным.

Количественное определение ионов кальция в фильтрате можно выполнить любым аналитическим методом, например методом пламенной фотометрии, но чувствительность метода не должна быть очень низкой.

Микроноситель, не сорбирующий ионы кальция, наиболее пригоден для культивирования клеток животной ткани.

5

0

5

0 5 0

0

5

В случае сорбции микроносителем 10% и более ионов кальция из раствора он полностью непригоден для использования.

При адсорбции микроносителем до 10% относительная пригодность его для практического использования тем выше, чем в меньшей степени он связывает ионы к.чль- ция.

Пригодность некоторых микроносителей для культивирования клеток животной ткани и способность этих микроносителей связывать ионы кальция даны в таблице.

Результирующие данные содержат в числителе величину, характеризующую степень сорбции микроносителем ионов клль- ция (в процентах), а в знаменателе - урожай клеток в расчете на 1 л среды. Во всех случаях культивирование клеток проводилось в одинаковых условиях на модифицированной среде Игла в течение 72 ч. Посевная концентрация составляла 0,4-10 кл/мл. Количество использованного микроносителя 1,5 г. Культивирование проводилось в оПъе- ме 500 мл.

П р и м е р 1. Микроноситель № 14 ВНИИОЧБ в количестве 1.5 г инкубируют в течение 60 мин в 50 мл раствора 10 М хлористого кальция. После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием, в фильтрате с помощью пламенного фотометра AAs-З Карл Пейс определяют концентрацию ионов кальция, равную 0,29 г/л. Следовательно, микроноситель сорбировал 0,09 г/л ионов кальция, что соответствует 5 23,7%.

Этот микроноситель используют для культивирования клеток ВНК-21. С этой целью в объем модифицированной Игла, равный 500 мл, вносят 1,5 г микроносителя и 0,4 10 кл/мл ВНК-21 в качестве посевного материала. Инкубирование продолжают 72 ч при температуре 36t1°C и интенсивности перемешивания 100 об/мин Урожай клеток составил 0,8 10 кл/мл.

П р и м е р 2. Микроноситель Цитодекс-1 (Cytodextm 1, Pharmacia Fch) в количестве 1.5 г инкубируют в течение 60 мин в 50 мл раствора хлористого кальция в концентрации 10 М. После инкубации микроноситель отделяют фильтрованием, а в фильтрате методом пламенной фотометрии определяют концентрацию ионов кальция, равную 0,38 г/л. Следовательно, микроноситель практически не связан ионами кальция.

Клетки ВНК-21, Vero инкубируют с этим микроносителем в условиях примера 1.

Урожай клеток составил 2,2-10 кл/мл.

Как следует из изложенного, предложенный способ позволяет в сроки, не пре0

5

вышающие 2 ч, определить пригодность конкретного микроносителя для культивирования клеток животной ткани. Благодаря этому сокращаются сроки исследований и получаются надежные результаты.

Предлагаемый способ особенно пригоден для оценки качества отдельных партий микроносителей, что позволяет исключить большие колебания в урожаях клеток, зависящие от особенностей отдельных партий микроносителя.

Способ универсален в том смысле, что позволяет оценить пригодность носителя для культивирования различных клеточных линий, хотя, естественно, абсолютная урожайность клеток будет зависеть от особен0

5

ностей клеточной линии и природы микроносителя.

Формула изобретения Способ определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных, включающий анализ микроносителя с последующим суждением о его пригодности для культивирования клеток животных, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени определения и повышения достоверности результатов, анализ микроносителя осуществляют путем его инкубирования в растворе соли кальция, а суждение выносят на основании отсутствия связывания им ионов кальция.

Изобретение относится к биотехнологии и касается культивирования клеток животных на микроносителях. Целью изобретения является сокращение времени определения пригодности микроносителя для культивирования клеток животных и повышение достоверности результатов. Для этого инкубируют микроноситель в растворе соли кальция, а вывод о его пригодности осуществляют на основании отсутствия связывания им ионов кальция. 1 табл.