Способ определения антител к ликопротеидам низкой плотности в крови Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике.

Целью изобретения является определение антител к липопротеидам низкой плотности (ЛИНИ) в сыворотке крови человека.

Сенсибилизация планшетов. В лунки 96-луночных полистироловых планшетов с плоским дном заливают 0,1 мл раствора, содержащего 10 мкг/мл ЛШШ, 0,02 М NaCl pH 8,0 (наслаивающий раствор). Планшеты закрывают крышка- ми и инкубируют при 36°С 2 ч и при 4°С 15-18 ч. По окончании инкубации

раствор ЛШШ удаляют и лунки триоды промывают 0,05%-ным раствором твина 20 1-2 мин и водопроводной водой.

Подготовка калибровочного материала. Разведения калибровочного материала, кратные двум, готовят на 0,01 у, растворе фасфатно-солевого буфера, рН 7,4 (СН) с 0,05%-ным раствором твина 20. Готовят смесь разведении от 1 мкг/мл до 15,6 нг/мл из донорских сывороток.

Внесение исследуемого и калибровочного материала. Калибровочный ма-| териал в носят в лунки в объеме 0,1 мл.

VI

О

ел

VJ

ь VI

Исследуемые образцы плазмы или сыворотки крови вносят по (1,1 мл при разведении 1:1(10 в ФСБ, содержащем 0,05% твина-20. После внесения материала планшеты закрывают крышками и инкубируют в термостате 3 ч при 52 С. Содержимое лунок удаляют, планшет промывают струей водопроводной воды, затем на 1-2 мин заполняют 0,05 твин-20 и вновь ополаскивают водопроводной водой. Процедуру отмывки планшета повторяют трижды.

Внесение конъюгата. В каждую лунку вносят по 0,1 мл разведенного раствора конъюгата пероксидаэы с антителами к иммуноглобулинам G человека и инкубируют 1 ч при 36°С. Отмывку планшета проводят аналогично описанной.

Внесение субстратной смеси и остановка ферментативной реакции. На 1 планшет готовят смесь, содержащую 5 мг ортофенилендиамина, 15 мл 0,05 М цитратного буфера, рН 7,4 и 10 мкл раствора гидроперита0 Субстратную смесь вносят в каждую лунку в объеме 0,1 мл и инкубируют в темноте при комнатной температуре мин. Остановку реакции проводят внесением в лунку по 50 мкл 25%-ной серной кислоты, после чего планшет встряхивают.

Регистрация результатов. Регистрацию результатов проводят с использованием фотометра с вертикальным ходом луча при длине волны 492 нм или визуально.

При инструментальной регистрации на миллиметровой бумаге строят калибровочную кривую зависимости поглощения от концентрации антител к Л11НП.

Для определения концентрации антител к ЛПНП в образце сыворотки на горизонтальной оси находят точку, соответствующую величине поглощения ее ферментативной реакции (среднее значение двух лунок) и результат умножают на 100 (скрининг-титр изучаемого образца сыворотки).

Апробация метода проведена на пуле донорских сывороток крови (не менее 1000 образцов).

Минимально определяемая концентрация аутоантител к ЛПНП 15,6 нг/мл сыворотки крови человека.

Пример 1. При изменении концентрации Nat 1 в наслаивающем растворе до 0,01 и О,(Ч К рН 8,0 проис0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ходит снижение количества нммобилизи- рованных ЛПНП, на 19 и 22/, соответственно определенное по количеству связываемых антител к ЛИШЬ

Пример 2. При изменении рН среды насливающего раствора до 7,0 и 9,0 происходит снижение количества иммобилизированных ЛПНП на 27 и 35% соответственно.

Пример 3. При изменении времени инкубации планшетов с 2 ч до

I и 3 ч при 36 1 С (последующая инкубация при 4°С общепринята) происходит снижение количества иммобилизи- рованных ЛПНП на 46 и 23% соответственно.

II р и м е р 4. При изменении концентрации наслаиваемых ЛПНП до 9 и

II мкг/мл происходит снижение количества иммобилизированных ЛПНП на 7 и 9% соответственно.

Пример 5. При инкубации ЛПНП в лунках планшета при 34°С и ЗН°С количество антител к ЛИНИ было определено равным 12,3 кг/мл и 11,8 кг/Нл соответственно. Режим инкубации при 36 С позволил определить количество антител, равное 15,6 кг/мл.

Таким образом найденный режим сорбции ППНП на твердой фазе позволяет проводить количественное определение антител к ЛПНП с помощью иммуно- ферментного анализа.

Формула изобретения

Способ определения антител к липо- протеидам низкой плотности в крови путем обработки твердой фазы раствором, содержащим 10 мкг/мл липопротеи- дов низкой плотности и 0,02 М Nad, рН 8,0 при 3b°C в течение 2 ч с дальнеЙ1 Л1м выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч и проведения последующих стадий твердофазного иммуно- ферментного анализа, включающий добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывание твердой фазы, нанесение на нее конъюгата пероксидазы с антителами к иммуноглоблину R человека, повторное отмывание, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксидаз- ной реакции и расчет содержания антител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой.

Изобретение относится к иммунологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике. Цель изобретения заключается в разработке способа определения антител к липопротеидам низкой плотности в крови. Твердую фазу обрабатывают раствором, содержащим Ю мкг/мл липо- протеидов низкой плотности и 0,02 К Nad, pH 8,0, при 36°С в течение 2 ч с дальнейшим выдерживанием при 4 С в течение 15-18 ч с последующи про- ведением стадий твердофазного имму- ноферментного анализа, которые включают добавление исследуемой сыворотки крови человека, инкубацию, отмывку твердой фазы, нанесение на нее конъю- гата пероксидазы с антителами к им- муноглобулину П человека, повторную отмывку, нанесение хромогенной субстратной смеси, остановку пероксидаз- ной реакции и расчет содержания антител к липопротеидам низкой плотности по калибровочной кривой.Разработанный способ позволяет определить минимальную концентрацию антител к липопро- теидам низкой плотности в сыворотке крови человека, равную 15,6 нг/мл. (Л